不容忽视! 慎选与优化抗体是ADC成功的重要一环
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前言
纵观这些文章之后，Mark Chiu博士提出一个问题：“大多数的综述都集中在连接子、毒素有效载荷和药物-抗体比值(Drug Antibody Ratio，DAR)上，但是对于抗体本身的选择、设计和优化没有足够的讨论。作为ADC重要组成部分之一，慎选与优化抗体对于成功开发ADC药物尤为重要。”
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ADC抗原的选择要素
抗原的选择是抗体药物开发的**步，同时也是最重要的一步，对于ADC来说，同样如此，合适的ADC抗原选择需要满足以下条件。
（1）在肿瘤中有较高表达，在健康组织中没有或较低表达
这是平衡有效性 vs安全性的重要考量，药物可以精确地靶向肿瘤细胞，但却不会损害正常健康的细胞。Her2就是一个很好的例子。例如Her2，Her2受体在肿瘤细胞上的表达高出正常健康细胞约100倍。
（2）抗原为肿瘤细胞表达上调(over-expressed)的表面受体，能够促进肿瘤生长和生存
选择具有这种特性的抗原，除了能够实现ADC药物的毒素有效载荷外，还能够起到阻断肿瘤抑制通路，加速消灭肿瘤的作用。
（3）靶抗原应具有内化特性，以便ADC能够转运到细胞内发挥毒性作用
该过程的一个关键步骤是内化，所以当我们为ADC选择靶抗原的时候，除了像选择一般单抗抗原所要求的条件外，还得要区分抗原是否能够随着抗体结合而内化。这里又涉及一些细分的知识要点，例如某些抗原内化速度非常快，有些抗原内化速度较慢，应该选择内化速度适中的抗原。
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抗体（antibody）作为ADC中的“A”，是负责将毒素运送到目标细胞的载体，因此需要其具有精确的靶向性，能够与靶抗原特异性结合。上面已经就抗原的挑选和注意事项进行过讲解，这里就不再作重复。
另外，在设计抗体的时候，还需要注意的是抗体对靶抗原的亲和力。
高亲和力的抗体可以确保毒素在肿瘤细胞内有更好的富集，但却具有更快的内化速率和降解速率，因而限制其对肿瘤的渗透力，所以它们对血管分布远端的肿瘤细胞的杀伤力较弱；低亲和力抗体内化速率和降解速率慢，在肿瘤细胞表面滞留时间较长，能够更有效地穿透肿瘤细胞，所以抗肿瘤活性更强。
生物分布研究显示，具有中等亲和力的单克隆抗体在静脉注射后24-120小时内的肿瘤积聚水平最高，而高亲和力的单克隆抗体则表现出最低的肿瘤积聚水平。
GPC3的抗体的三种结合表位
相较于抗体的特异性和亲和力，抗原与抗体的结合表位却很少有人关注，其实抗原与抗体结合表位也是决定ADC活性的一个重要因素。这里还是举例分析，例如三款靶向GPC3的抗体：结合表位靠近细胞膜的YP7（Kd~0.3nM)、与GPC3肝素聚糖结合的HS20 （Kd 不详因结合部分并非蛋白）、和结合细胞膜远端表位的HN3纳米抗体（Kd~0.7nM)。通过一系列研究显示，使用结合表位在细胞膜远端的HN3开发的ADC效果**。
不仅仅只有以上个例，还有另一组实验，使用不同表位的HER2单抗分别链接ETA（ Pseudomonas Exotoxin A ），成为一组结合表位不同的HER2 ADC，然后在不同HER2表达水平的肿瘤细胞系中评估它们的细胞毒性。结果显示，与ErbB受体结合而没有抑制异源二聚体的HER2 ADC的抗体内化和ETA介导的细胞毒性要优于抑制了异源二聚体的HER2 ADC。总而言之，尽管这些HER2单抗的EC50值没有明显不同，但是它们的内化和ADC杀伤谱却是显著不同的。
HER2单抗的特征对比
mAbs (2014) 6 (2):392-402 dx.doi.org/10.4161/mabs.27705
目前还有其它研究通过降低内体pH值，在酸性的条件下提高ADC的靶向特异性和亲和力，以提高ADC的效力。这种工程化的ADC分子对HER2表达水平处于中间的肿瘤细胞显示出更强的溶酶体传递和细胞毒性。
ADC从血管释放到病变组织的模型。ADC的结合位点屏障可以通过与靠近血管的细胞接触而发生，并限制向远离血管的细胞输送。
AAPS J 22, 12 (2020). https://doi.org/10.1208/s12248-019-0390-2
ADC的穿透能力取决于其分子的大小，大分子（<1.5 kDa）和小蛋白（<40 kDa）都可以通过肿瘤组织扩散，但因为同质性高，所以肿瘤内聚集量较低。一般来说，治疗分子在40-800kDa（流体动力学半径~5-100nm）范围内，肿瘤内扩散减弱，一旦被摄取，就会在肿瘤内聚集，但在健康组织中则不会发生。
实体瘤的治疗比血液肿瘤更为复杂，因为实体瘤会形成一种“结合部位屏障”（Binding Site Barrier，BSB），能阻止ADC药物渗透到肿瘤细胞之中。当抗体亲和力太高时，抗体和抗原的结合会过于紧密，导致ADC药物分布集聚在血管附近，从而导致远离血管区域的ADC药物分布较少。曾有生物分布实验显示具有中等亲和力的抗体在静脉注射后 24 小时和 120 小时内表现出最高水平的肿瘤积累。与之相反，高亲和力的抗体则显示出肿瘤积累的最低水平。此外，高亲和力的抗体一般更易被降解，从而限制了它们对肿瘤的渗透力。当抗体-抗原分离率高于抗原内化率，低亲和力的抗体会更胜一筹，一般能更有效地穿透肿瘤。
对于这一挑战，可以通过工程化ADC的抗体部分来调节ADC药物对肿瘤的穿透性和半衰期。例如将赫赛汀（曲妥珠单抗）的全长完整抗体或其人源化单链抗体与~30kda重组胶凝蛋白毒素（Gelonin）融合转化为ADC，全长Herceptin-Gelonin RIT的循环稳定性（半衰期~42 min）是scFv Gelonin（半衰期~32.3 min）的1.3倍，但后者在肿瘤穿透方面更有优势，其中的原因可能是由于BSB的关系。
在这里可以看出，ADC的大小可能比活性更为重要，尤其是在BSB存在的情况时。这里也给我们一个提示，就是ADC分子的大小和治疗效果的真正关系究竟如何？对于这个问题，可以在未来进行更多的研究来分析。
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药代动力学(PK)/药效学(PD)
ADC的大小对全身分布至关重要，因为基于scfv的小ADC从循环系统中清除得更快，血清半衰期仅为20分钟，而裸单抗体则为1-2周。对于ADC生物分布的测定，像抗体一样，从生物物理学和生物学角度来看，都是同样重要。像单克隆抗体一样，ADC利用血管和淋巴系统进行传输。因此，ADC的表面电荷、ADC对FcRn的亲和性或结合性的改变，或ADC在理化性质上的变化，都可能是影响组织分布的关键因素。
同时，低免疫原性可以使“抗药物抗体”(ADA)的产生减少。通常，ADA对治疗性蛋白有免疫相关不良事件的风险，其中包括输注相关反应、过敏反应、迟发性超敏反应和自身免疫等等。治疗性单抗导致的ADAs的免疫原性可以通过框架人源化和使用具有人源性生殖系的动物来增加人类序列的内容来减轻。这种方法可以将嵌合抗体的常见免疫原性从40%降低到人源化抗体的9%左右。
此外，为了使脱靶效应降至最低，ADC药物应该具有与人体其它组织的最小交叉反应。为了帮助预测ADC的脱靶副作用，预先筛选ADC药物与人体组织细胞的结合是值得推荐的。然而，在测试过程中，保留相关结合所需的 “构象表位” （Conformational Epitope）是至为重要的。对于健康的成人组织尤其是心脏和肺部，只要ADC的结合较少甚至完全没有，脱靶的风险就相对较低。
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关于耐药和毒性
众所周知，靶抗原表达是影响单抗对靶点识别和疗效的重要因素，尤其是考虑到不同病人在靶抗原表达中所存在的差异。通常，肿瘤靶抗原表达水平较低的病人治疗时失败的风险会相对增加。此外，癌细胞也可通过降低靶抗原表达水平而造成耐药 。例如，CD56阴性的多发性骨髓瘤患者中有20%会对ADC产生耐药。因此，在开始治疗前预先筛选好靶抗原表达的相关生物标志物尤为重要。
另外，如果病人在 ADC 药物治疗获得初步疗效后肿瘤却突然持续进展和扩散，这可能与靶抗原的下调有关 。文献上就有报道过用 CD38 或 BCMA 抗体治疗骨髓瘤时，靶抗原下调而产生耐药的多个案例。最后，多发性骨髓瘤存在已知的“克隆内异质性“ （intra-clonal heterogeneity）。因此，如果长期 ADC 给药，可能会造成低靶表达的亚克隆（sub-clone）的疯长，因而导致肿瘤进展和扩散。所以，更好地了解耐药机制将有助于改进ADC药物的设计，或提供更有效的联合用药策略。
近来，一些研究小组正在探索将 ADC 与 MDR1 抑制剂联用以防止ADC 载荷的毒素从癌细胞中过早被排出。此外，作为另一种策略，免疫结合物也可以与增加靶抗原表达的药物联合使用来增加疗效。例如，Belantamab-Mafodotin ADC 在与 γ-分泌酶抑制剂（用以增加BCMA密度）的联用后发现可以降低 BCMA低表达骨髓瘤亚克隆的出现，从而达到预防或延缓癌症进展的目的。类似的策略也曾将 CD38 免疫结合物与增加CD38表达的药物联用，如ATRA、Panobinostat 或 DNA甲基转移酶等，疗效亦非常不错。这类联合用药策略在未来前景看好。
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未来研究方向
虽然与癌细胞上的表位相结合，在很大程度上决定了ADC的特异性，但只选择单一靶点存在一定的坏处。例如，使用 Blinatumomab 来靶向恶性肿瘤B细胞上的CD19靶点，会导致 CD19 的下调。
对于这个问题，一个潜在的解决办法是同时靶向两个不同的靶点来增强抗原的识别和结合。例如，DT2219 就是一种双特异性ADC，它能同时靶向CD19和CD22，这样便能减少因为部分肿瘤靶点下调而造成的问题。
最后，ADC当然也可造成对正常健康组织细胞的毒性。因此，使用双特异抗体来增加对肿瘤细胞的特异性也可相对地减少这个问题。不过，要优化一款ADC药物，必须兼顾结合臂（binding arms）和表位的选择、ADC 分子本身的大小、分子结构、内吞率和体内的药代等多方面的平衡和配合。
总体而言，除了Linker、Toxin、和DAR外，ADC药物设计还有许多方面需要关注。本文列出的例子，主要就如何提高疗效、降低毒性、优化PK和生物分布、以及降低耐药等问题来进行综述。希望个人提出的一些小小建议能帮助大家为病人开发出更好的 ADC 新药。
Tavotek专注于ADC抗体的工程设计和优化。TavoSelect噬菌体库是获得多种全长人源单抗和单域人源VHO抗体的有效方法。这些构建基块随后被整合成双特异或多特异抗体后，便可用来开发ADC新药。TavoPrecise平台则可设计出独特的蛋白质结构，以减少结合位点屏障（BSB），加强靶细胞的内吞，和优化靶细胞的分子活性。最后，Tavotek的工程设计亦可降低ADC对正常健康组织的接触，从而增加这类药物的安全性。
多种可用于ADC的抗体设计例子
Shim (2020) Biomolecules 2020, 10, 360; doi:10.3390/biom10030360
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结语
当然，对于ADC这种机制的药物来说，不一定要用单抗或者其衍生抗体药物作为特异性介导域，例如其他能够与抗原特异性结合的分子（比如白介素、蛋白质等等）也是很好的选择。
例如，美国FDA批准用于治疗复发性皮肤T细胞淋巴瘤的Denileukin diftitox (Ontak)，就是一款白喉毒素与IL-2偶联的药物，通过IL-2与CD25阳性细胞的结合，以达到对调节T细胞等细胞的耗竭作用。同时，也有不少研究课题正在尝试利用不同的靶向分子进行偶联毒素，这也正是现在学术界为什么出现了“PDC”，甚至“VDC”、“RDC”等这些新术语的原因。
总之，在可以预见的将来，会有越来越多的ADC变体药物出现，但一个不变的策略是，一个靶向分子与毒素的有效载荷，然后递送到目标细胞进行杀伤。
最后，也希望本文能够帮助读者更好的了解ADC药物，为患者开发出更好的新药。
Mark Chiu博士深耕医药行业30余年，拥有20多年跨国药企生物药物研发、主要管线资产开发和管理的经验；同时在学术方面亦具有深厚的研究功底，曾师从两位诺贝尔奖得主，并曾担任过业内多个重大科学委员会的董事。Mark博士曾在美国强生和雅培的多个关键研发部门担任过领导职务，使用集成多特异抗体技术, 在短短3年内为强生研发出9个新分子实体(NME), 领导其团队创造出在1年内从概念到NME开发的纪录, 并在短短2.5年内开展一期临床试验。Mark博士曾负责和领导多个重磅生物制药产品的早期研发，也曾为美国雅培公司研发出各种主要管线资产例如:ABT165, ABT414, ABT530, ABT555, ABT981等。