【干货分享】CAR-T细胞疗法治疗血液系统恶性肿瘤的未来之路

作为一种崭新的治疗方案，CAR-T细胞在过去的三十年中经受了时间的考验，其许多产品现已获得美国食品和药物管理局（FDA）的批准[6,7]。

CAR-T细胞疗法的优点是完成所需的治疗时间短。在长期缓解方面，它比其他传统癌症治疗得分更高，患者的生活质量更高。与干细胞移植也需要积极的化学疗法相比，大多数患者可以通过CAR-T细胞疗法快速恢复[8]。与依赖于靶细胞的主要组织相容性复合体（MHC）表达进行抗原识别的TIL和TCR不同，CAR-T细胞可识别特异性抗原，而不受靶细胞对抗原的加工和MHC限制，从而依次杀伤肿瘤细胞有效[3,9,10]。

CAR-T细胞疗法的过程 CAR-T细胞疗法的基本过程涉及血液分离，然后是白细胞分离，我们从患者体内抽血，并分离淋巴细胞（白细胞）。然后将其转发给基因工程实验室，然后通过无活性病毒/非病毒载体将基因插入T细胞，以在其表面产生嵌合抗原受体（CARs）。这些经过重新设计的CAR-T细胞在实验室中繁殖了大约2至3周，然后冷冻并送去重新输注[3,6,11,12]。同时，我们进行条件化学疗法以降低患者的白细胞，并为融化的CAR-T细胞输液奠定了基础。然后，CAR-T细胞通过颗粒酶/穿孔素介导的凋亡帮助杀死肿瘤细胞[12,13]。我们在下图中总结了CAR-T细胞向患者的生产和运输过程（图3）。

CAR-T细胞由细胞外，跨膜和细胞内结构域以及柔性铰链组成，这也增加了靶标识别效率[11]。细胞外结构域具有识别肿瘤相关抗原的抗原结合结构域，即单链可变片段（scFv）。细胞内结构域由TCR复合物CD3ζ链的基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM）组成，该激活基序激活了共刺激信号[3]。

CAR技术正在得到广泛的研究，并发展到了连续几代人。**代CAR包含单链可变片段（scFv），接头，跨膜结构域和细胞内CD3ζITAM [2,14,15]。第二代CAR具有额外的细胞内共刺激结构域，例如CD28或4-1BB受体（CD 137）。第三代CAR具有两个额外的共刺激域，例如CD 28或CD 4-1BB和CD134。第四代CAR-T细胞还由各种共刺激成分组成，例如细胞因子，抗体或其他功能性蛋白质[14] ，15]。他们可以识别并去除一些早期T细胞无法识别的抗原。下面列出了不同世代修饰和精制的CAR-T细胞的摘要（图1）。

CAR技术在血液系统恶性肿瘤治疗中的应用

迄今为止，CAR-T细胞疗法已在多种血液系统恶性肿瘤中进行了试验和测试，包括复发/难治性（r/r）套细胞淋巴瘤，B细胞非霍奇金淋巴瘤-B-NHL（原发性纵隔B细胞淋巴瘤，弥漫性大细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤），多发性骨髓瘤（MM），慢性淋巴细胞性淋巴细胞性白血病（CLL），成人和儿童复发/难治性急性淋巴细胞性白血病（ALL）[7,16,17]。B-ALL患者中CD19特异性的CAR-T细胞可以达到70-94％的平均完全缓解率[2,18]。

专业人士一直在研究CAR-T细胞疗法，其中包括许多排列组合以及失败/复发，难治性治疗以及迄今为止取得的一些积极进展。此外，其中有几项获得了FDA的批准，包括诺华公司的Kymriah，该产品主要用于ALL患儿和青壮年，也用于弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中。Gilead的Yescarta，用于DLBCL；和Kite的Tecartus被接受为r/r套细胞淋巴瘤的首个CAR-T治疗药物[6,19-22]。

围绕血液恶性肿瘤的临床试验表明，CAR-T细胞疗法已帮助多年无效的多种癌症治疗患者缓解。[8]此外，它还可以防止他们的癌症恶化，帮助他们更长寿，并且在少数情况下，他们还可以从干细胞移植等治疗中受益[14]。但是，局限性在于复发，这可能是由于抗原逃逸和CAR-T细胞的持久存留所介导的[18]。

嵌合抗原受体技术的挑战

尽管CAR疗法具有无可否认的益处，但在使用CAR疗法时，仍然需要对许多副作用进行严格的检查。在大多数患者中，神经毒性和细胞因子释放综合征（CRS）是常见的副作用。其他还包括与CAR-T细胞相关的脑病综合征，巨噬细胞活化综合征，吞噬性淋巴细胞组织细胞增生，移植物抗宿主病，靶标/肿瘤外毒性，过敏反应和感染[3,8,23,24]。由于过度的T细胞增殖和癌细胞的破坏，导致发生CRS，从而在体内引起免疫反应[3,16]。在大多数使用抗CD19 CAR-T细胞疗法的患者中，神经毒性是一种副作用。神经毒性的证据包括内皮功能障碍，血管不稳定，毛细血管渗漏，血脑屏障破坏和弥散性血管内凝血（DIC）[3,23,25]。由于相同的分子生物标记物可以在某些正常组织或器官中表达，尤其是在淋巴组织中，因此CAR-T细胞疗法可以破坏正常组织，称为靶上/肿瘤外毒性，例如抗CD19中的B细胞发育不全/ 20CAR-T细胞治疗[3]。

尽管该领域的研究不断增长，但有限的T细胞持久性导致复发和不良反应成为该方法广泛使用的瓶颈。通过这篇综述文章，我们打算深入了解CAR-T细胞疗法的优势和成功结果，广泛采用的障碍以及旨在防止耐药性和复发的正在进行的研究的预期方式，而不仅仅是关注于抗癌和复发。

搜索策略和研究选择

在这篇评论中，我们使用PubMed以及Medline和PubMed Central等其他电子数据库来搜索相关出版物。在搜索过程中输入的关键字包括“过继免疫疗法”，“血液系统恶性肿瘤”，“免疫疗法和血液系统恶性肿瘤”，“ CAR-T细胞疗法”，“下一代CAR-T细胞”，“批准的CAR-T治疗” 从2014年1月至2020年11月搜索文章，然后将其导入Mendeley，以查找“ CAR疗法的副作用”，“ CAR-T细胞设计”，“ CAR治疗中的安全性策略”和“ CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤中的应用”。在删除重复项后，我们使用纳入和排除标准对所有标题和摘要进行了审查。

CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中的应用

对肿瘤抗原具有重定向特异性的基因修饰的自体T细胞可以结合细胞疗法（放大应答），抗体疗法（特异性）和疫苗疗法（记忆活性）的优势。

嵌合抗原受体-T细胞疗法已成为新兴的癌症免疫疗法，已显示出显着的效果，尤其是在血液系统恶性肿瘤中。这些疗法的广泛探索工作已成功治疗儿童和成人的恶性肿瘤，如复发性B细胞急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞性白血病，包括非霍奇金淋巴瘤在内的淋巴瘤。r/r滤泡性淋巴瘤（FL）;并弥漫性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤[3]。

CAR-T细胞疗法的临床试验主要集中在CD19，CD20，CD22，CD30，CD38，BCMA，GPC3和其他**的抗原靶标上。在美国，靶向CD19的临床试验占CAR-T细胞试验的40％以上。截至2017年8月，全球约有200项涉及CAR-T细胞的临床试验，其中约65％涉及血液系统恶性肿瘤，其中80％涉及靶向B细胞癌的CD 19CAR-T细胞[2]。目前，临床研究中的CAR-T细胞项目涉及48个以上靶标。截至2020年6月，已在**进行了357项临床试验，在美国进行了256项试验，在其他国家进行了58项试验[29]。

CAR-T细胞疗法广泛应用的局限性

1、不利的副作用

输注CAR-T细胞后，由于细胞在体内繁殖以对抗癌症，患者可能会遇到一些严重的副作用，例如CRS和神经毒作用[3,6,25,31]。这些副作用的程度（表2）和CAR治疗的疗效取决于患者先前接受的治疗，淋巴结清扫的量，化疗方案以及输注时的疾病程度[28,32,33]。

2、影响CAR-T细胞活性潜能的因素

其他因素，例如免疫原性（在反复给药的情况下，应使用人源化scFvs而非小鼠抗体以预防过敏反应或其他严重功能障碍），肿瘤微环境中的免疫抑制成分，在CAR-T输注前进行免疫抑制预处理（导致贫血，凝血病，和中性粒细胞减少症）可能会影响CAR-T细胞的活性和安全性[10,32]。在完成治疗后，癌症复发率也是与CAR-T细胞疗法的整体功效有关的重要问题[18,38,39]。

改善CAR-T细胞治疗安全性和效率的最新进展，以应对其应用中的挑战

1、下一代CAR-T细胞

研究人员已经在开发一些安全策略，以预防或减少CAR-T细胞疗法的不利影响。这样制造的T细胞被称为下一代CAR-T细胞[9,28,31,40]。

自杀基因转换：包括在CAR T细胞中表达特定基因，该基因作为“安全自杀基因转换”（通过施用无毒分子或相关单克隆抗体激活），只要有发展就会破坏CAR-T细胞严重毒性[9,31]。

合成分裂受体：在Lim及其同事提出的合成分裂受体中，T细胞活性的时间，位置和剂量可以通过药理学调控精确而远程地控制。在该系统中，抗原结合和细胞内信号传导成分在没有小分子的情况下被分离，并且在用异二聚化小分子处理后开始组装。因此，可以在体内用该小分子有效地控制CAR-T细胞，并且可以简单地通过改变小分子的剂量来调节诸如靶细胞杀死的应答的幅度。Juillerat等人的另一种合成分裂受体。可以通过添加小的二聚化分子药物，将CAR结构直接在铰链结构域激活。在以剂量依赖的方式使用分子诱导剂后，工程化的CAR-T细胞表现出显着的细胞裂解活性。这些新型可控CAR-T细胞的开发，通过提高临床中CAR-T细胞疗法的安全性，开创了新颖且有吸引力的方法来控制潜在的不良反应[9,28]。

组合靶抗原识别：涉及用两种不同的CAR改造T细胞，只有在识别出同时在肿瘤细胞上表达的一组不同抗原后，才能完全激活T细胞。例如，CAR+嵌合共刺激受体，双特异性串联CAR的组合。仅表达这些抗原之一的正常细胞不能激活这些T细胞，从而显着降低靶点上/肿瘤外的毒性[9,28]。

合成Notch受体：合成Notch（synNotch）受体的最新发展有助于避免天然T细胞，从而克服了免疫疗法中的毒性。SynNotch由细胞外抗原识别域（通常是单链可变片段，scFv），Notch核心调控区和细胞内域（ICD）组成[9,28,40]。SynNotch受体使用胞外域识别靶抗原。然而，如在CARs中所见，靶抗原的结合不会触发T细胞活化。一种抗原的synNotch受体驱动靶向第二种抗原的CAR的后续表达。仅当两种抗原均存在时，T细胞才能被激活。具有这些受体的T细胞可改善其有效性和安全性[9,28]。

双特异性T细胞衔接子（由两个单链抗体组成的BITE抗体）：双特异性T细胞衔接子是通过一个接头（连接子）连接两个scFv而构建的，该接头可以同时与两个特异性抗体（scFv）结合[9,28]。scFv中的一个通过CD3受体与T细胞结合，另一个通过肿瘤特异性抗原与肿瘤细胞结合。在没有小双特异性分子的情况下，这些CAR-T细胞对正常组织没有活性。这些细胞提高了T细胞的效力和肿瘤选择性，从而增强了它们的功效和安全性[9,28]。一种针对CD19的单克隆抗体Blinatumomab已于2014年获批用于复发和难治性B细胞ALL。与酪氨酸激酶抑制剂一起使用时，它们在改善长期预后方面是安全有效的[31,41]。

抑制性嵌合抗原受体：将抑制性受体应用于CAR-T细胞是一种安全策略。抑制性嵌合抗原受体（iCAR）由对正常组织表达的抗原具有特异性的scFv和强大的抑制性信号传导域（来自PD-1和CTLA-4）组成，以限制肿瘤外T细胞的活性。iCAR以暂时和可逆的方式显示出抗原特异性抑制T细胞活性，细胞因子分泌和增殖[9,28,40]。

2、联合疗法

研究人员已尝试将CAR-T细胞疗法与化学疗法和放射疗法相结合，以克服对CAR-T细胞疗法使用的限制，减少疾病的不良反应，增强肿瘤抗原的识别能力，并提高CAR-T细胞疗法的疗效和持久性T细胞[2,41]。CAR-T细胞和检查点抑制剂疗法（靶标PD-1和PD-L1，CTLA-4和B7相互作用）的组合也可以解决抗原逃逸的问题[42]。

探索的其他领域

改善CAR-T细胞能力，抵抗TME并降低免疫原性的其他新研究领域包括：

（1）多目标CAR-T细胞技术；

（2）T细胞制造方面的改革（例如，降低与使用病毒载体相关的风险，包括DNA损伤，并降低生产成本和生产时间：通过以非病毒为基础的技术替代它们，例如SleepingBeauty和PiggyBac换位导致产生具有高持久性和低DNA损伤的T细胞[38,43]，从而解决了各种潜在的与插入相关的突变）；

（3）基因编辑技术，包括使用非整合型慢病毒载体，通过配备趋化因子基因的溶瘤病毒募集CAR-T细胞，利用CRISPR/cas9技术生成CAR-T细胞（聚簇的规则间隔的短回文重复序列/CRISPR-相关蛋白九）和使用CAR-NK（自然杀手）细胞[2,44]。

除了上述技术方面，要使CAR治疗更容易获得，还有一个领域需要解决，那就是所涉及的巨额费用。目前，在美国，Tiga-Cel（Kymriah）的价格为$ 475,000，而Axi-Cel（Yescarta）的价格为$ 350,000，这对于世界上大多数人来说可能负担不起，这限制了这种疗法的使用[39]。我们列出了各种可能的解决方案，以克服CAR-T治疗的局限性，以帮助理解和更快地过渡到临床领域中的应用（图4）。

ELIANA和ZUMA试验的成功，导致FDA批准了几种CAR-T细胞疗法，导致了与第四代和下一代CAR-T细胞相关的渐进研究，包括****，这些技术已经处于不同的阶段。世界各地的临床试验[45,46]。只有大规模取得实质性积极成果，才能建立长期利益。因此，我们最终推断，需要进行创新的实验研究以增强CAR-T细胞疗法进展的有效性，这将为医生和患者提供消除恶性肿瘤的信息和疗法。

在这篇综述中，我们概述了CAR-T细胞疗法的发展现状，其在血液系统恶性肿瘤中的应用，局限性，应对挑战的最新研究进展以及将其应用推广和扩展到现有和各种用途的未来研究范围其他癌症治疗。通过这次审查，我们打算为该领域的学生，研究人员和同事提供参考，以更好地了解CAR-T细胞疗法的当前和未来趋势。

Published: February 25, 2021

DOI: 10.7759/cureus.13552

文章来源：晨曦   药启程