【干货分享】PCR类型及其应用的特定目的

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一项彻底改变分子生物学领域及其他领域的技术。在本文中，我们将讨论PCR的简要历史及其原理，重点介绍PCR的不同类型及其应用的特定目的。

PCR原理和历史

1983年，美国生物化学家Kary Mullis深夜驾车回家时，灵感一闪而逝。他在一张收据的背面写了一个想法，该想法最终使他获得了1993年诺贝尔化学奖。这个想法很简单：在实验室的试管中复制发生在细胞中DNA的复制过程。而这个过程的结果是相同的：在现有的基础上生成新的互补DNA（cDNA）链。

穆利斯以Sanger的DNA测序基础为新技术的起点。他意识到重复使用DNA聚合酶会引发连锁反应，从而导致特定DNA片段的扩增。

他的想法基础是在1976年从温泉中发现的Thermus aquaticus细菌中分离出来的一种热稳定的DNA聚合酶Taq奠定的。Taq DNA聚合酶的**温度为72°C，长时间暴露于高达96°C的温度下仍能存在，这意味着它可以耐受多个循环。

在发现Taq聚合酶之前，分子生物学家已经在尝试优化循环方法的DNA扩增方案，但是他们需要在每个循环中添加新的聚合酶，因为该酶不能承受DNA变性所需的高温。具有热稳定性酶意味着它们可以重复扩增过程多次，而无需在每个循环中都使用新的聚合酶，从而使整个过程具有可扩展性，更高效且耗时更少。

使用Taq聚合酶的这种聚合酶链反应（PCR）的首次描述发表在1985年的《科学》杂志上。

1993年，**个FDA批准的PCR试剂盒投放市场。从那时起，PCR一直在稳定和系统地得到改进。从法医证据分析和诊断到疾病监测和基因工程，它已成为改变一切的游戏规则。这无疑是20世纪最重要的科学进展之一。

标准PCR实验概述

PCR用于从称为模板DNA的起始材料的复杂混合物中扩增特定的DNA片段。样品制备和纯化方案取决于起始材料，包括样品基质和靶DNA的可及性。通常，需要最少的DNA纯化。但是，PCR是需要了解要扩增DNA片段（称为靶DNA）两侧的DNA序列信息。

从实用的角度来看，PCR实验相对简单，可以在几个小时内完成。通常，PCR反应需要五种关键试剂：

1. 要扩增的DNA：也称为PCR模板或模板DNA。 该DNA可以来自任何地方，例如基因组DNA（gDNA），cDNA和质粒DNA。

2. DNA聚合酶：所有PCR反应都需要可在高温下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一种常用的酶，它可以在70°C时以60个碱基/秒的速率整合核苷酸，并可以扩增高达5kb的模板，使其适用于无特殊要求的标准PCR。科学家正在设计一种新一代的聚合酶以改善其反应性能。例如，某些被设计为仅在高温下被激活，以减少反应开始时的非特异性扩增。其他一些功能则具有“校对”功能，例如，在至关重要的实验中，例如在克隆过程中，需要扩增的序列与模板序列完全匹配时，这一点很重要。

3. 引物：DNA聚合酶需要短序列的核苷酸，以指示它们需要在哪里开始扩增。在PCR中，这些序列称为引物，是单链DNA的短片段（约15-30个碱基）。在设计PCR实验时，研究人员确定要扩增的DNA区域，并设计一对专门位于目标区域侧翼的引物，一个在正向链上，另一个在反向链上。引物设计是PCR实验的关键组成部分，应谨慎进行。必须选择引物序列以靶向独特的目的DNA，避免与相似序列结合的可能性。它们应该具有相似的熔化温度，因为退火步骤对两个线材同时进行。与腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）相比，鸟嘌呤（G）或胞嘧啶（C）的碱基百分率会影响引物的解链温度，而更高的GC含量会提高解链温度。调整引物长度可以帮助在匹配引物对时对此进行补偿。避免易于形成二级结构或引物二聚体的序列也很重要，因为这会降低PCR效率。许多免费的在线工具可用于辅助引物设计。

4. 脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：它们是合成DNA新链的基础，包括四个基本DNA核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）。dNTP通常以等摩尔量添加到PCR反应中，以实现**的碱基掺入。

5. PCR缓冲液：PCR缓冲液可确保在整个PCR反应过程中保持**条件。PCR缓冲液的主要成分包括氯化镁（MgCl2），tris-HCl和氯化钾（KCl）。MgCl2充当DNA聚合酶的辅助因子，而tris-HCl和KCl在反应过程中保持稳定的pH值。通过混合上述试剂并将试管放入热循环仪中，在单个试管中进行PCR反应。

PCR扩增包括三组被设定好的时间和温度，步骤称为：变性，退火和延伸（如下图1）。

图1：单个PCR循环的步骤。

每个步骤，称为周期，重复30-40次，每个周期的DNA量加倍和获得的扩增（如下图2）。

图2：通过PCR扩增DNA分子的不同阶段和循环。

下面让我们仔细了解和学习每个步骤。

1、变性：PCR的**步称为变性，将模板DNA加热到95°C几秒钟，将两条DNA链分开，使它们之间的氢键迅速断裂。

2、退火：然后将反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50-65°C，但是确切的**温度取决于引物的长度和顺序。必须对每套新的引物进行仔细的优化。

两条DNA链可以在此温度下重新连接，但是大多数不会，因为该混合物包含大量过量的引物，这些引物在特定的互补位置与模板DNA结合或退火。退火步骤完成后，模板DNA和引物之间将形成氢键。此时，聚合酶已准备好延伸DNA序列。

3、扩展：然后将温度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作温度，通常约为72°C，对于Taq而言约为74°C。

DNA聚合酶附着在每个引物的一端，并合成与模板DNA互补的DNA新链。现在，我们有4条DNA链，而不是最初的2条。

温度升至94°C，“原始”分子和新合成的双链DNA分子再次变性为单链。开始变性-退火-延伸的第二个循环。在第二个循环的末尾，有八个分子的单链DNA。通过重复循环30次，开始时存在的双链DNA分子将转化为超过1.3亿个新的双链分子，每个分子都是两个引物的退火位点所描绘的起始分子区域的一个副本。

为了确定扩增是否成功，可以使用凝胶电泳显示PCR产物，指示扩增子的存在/不存在，大小和大约浓度。根据应用和研究问题，这可能是实验的终点，例如，确定是否存在基因。否则，PCR产物可能只是进行更复杂的下游研究（如测序和克隆）的起点。

PCR的不同种类

由于它们的多功能性，PCR技术在最近几年得到了发展，导致了PCR技术的发展为几种不同类型。一些最广泛使用的类型是：

1、定量实时PCR（qPCR）

最有用的发展之一是定量实时PCR或qPCR。顾名思义，qPCR是一种定量技术，可实时监控扩增过程并检测PCR产物的制备。可以用来确定目标DNA的起始浓度，在许多情况下无需进行凝胶电泳。这要归功于包含非特异性荧光嵌入染料，该染料在与双链DNA结合时会发出荧光，或者包含DNA寡核苷酸序列特定的荧光探针（例如水解（TaqMan）探针和分子信标）。探针与扩增子内的DNA靶序列特异性结合，并使用Förster共振能量转移（FRET）原理通过一端的荧光分子与另一端的淬灭剂偶联产生荧光。对于荧光染料和探针，随着目标DNA拷贝数的增加，荧光水平成比例地增加，从而允许参照包含已知拷贝数的标准品对扩增进行实时定量（如下图3）。

图3：用于定量未知样品中拷贝数的示例qPCR扩增图和标准曲线。

qPCR使用配备有荧光检测系统的专用热循环仪，该系统可在扩增发生时监控荧光信号。

2、逆转录PCR（RT-PCR）

逆转录（RT）-PCR和RT-qPCR是两种常用的PCR类型，可在临床和研究环境中进行基因转录分析和病毒RNA定量。

RT是从单链模板RNA制备cDNA的过程，因此也称为**链cDNA合成。RT-PCR的**步是合成RNA模板和DNA寡核苷酸引物之间的DNA/RNA杂交体。催化此反应的逆转录酶具有RNase活性，该酶随后会降解RNA部分。随后，通过逆转录酶的DNA聚合酶活性合成单链DNA分子。高纯度和高质量的起始RNA对于成功的RT-PCR至关重要。

可以通过以下两种方法进行RT-PCR：一步式RT-PCR和两步式RT-PCR。在**种情况下，RT反应和PCR反应在同一试管中进行，而在两步RT-PCR中，两个反应是分开的，并依次进行。

3、逆转录定量PCR（RT-qPCR）

上述逆转录通常也用作qPCR的**步，即定量生物样品中的RNA（RNA转录本或来源于病毒RNA基因组）。

与RT-PCR一样，通过RT-qPCR定量RNA的方法有两种：一步式RT-qPCR和两步式RT-qPCR。在这两种情况下，都首先将RNA反转录为cDNA，然后将其用作qPCR扩增的模板。在两步法中，逆转录和qPCR扩增是作为两个单独的实验顺序进行的。在一步法中，RT和qPCR在同一试管中进行。

4、数字PCR（dPCR）和数字液滴PCR（ddPCR）

数字PCR（dPCR）是原始PCR协议的另一种改进。与qPCR一样，dPCR技术使用DNA聚合酶使用引物组和探针从复杂样品中扩增靶DNA。但是，主要区别在于最后是PCR反应的分区和数据采集。

dPCR和ddPCR基于有限稀释的概念。PCR反应分为大量的纳升大小的亚反应（分区）。在每个液滴内进行PCR扩增。PCR之后，用泊松统计（一种统计与概率学里常见到的离散概率分布）分析每个液滴，以确定原始样品中PCR阳性液滴的百分比。一些分区可能包含目标的一个或多个副本，而其他分区可能不包含目标序列。因此，分区将分类为正（检测到目标）或负（未检测到目标），从而为数字输出格式提供了基础。

ddPCR是一种新技术，于2011年投入应用。ddPCR利用水油乳剂形成分隔模板DNA分子的分隔物。液滴本质上用作发生PCR反应的单个试管。

5、微流控PCR

具有微通道和微腔室的微流体处理系统的最新发展为一系列实际应用铺平了道路，包括在微流体芯片上通过PCR扩增DNA。

芯片上进行的PCR得益于微流体技术在速度，灵敏度和低试剂消耗方面的优势。这些功能使微流体PCR特别适用于即时检验，例如用于诊断应用。从实用的角度来看，样品流经微流体通道，反复通过三个温度区，反映了PCR的不同步骤。10μL样品仅需90秒即可执行20个PCR循环。随后可以在芯片外轻松进行后续分析。

PCR优点与不足

不同的PCR方法都有其优缺点，这会影响它们适合的应用。这些总结在下表1中。

表1：不同PCR方法的主要优缺点。

PCR应用

PCR已成为现代分子生物学中必不可少的工具，并已彻底改变了科学研究。该技术还向分子生物学领域以外的领域开放了对细胞和分子过程的研究，因此也被许多学科的科学家发现了其实用性。

尽管PCR本身是一种功能强大的独立技术，但它也已作为更广泛的技术（例如克隆和测序）并入了这些工作流程的一小部分。PCR的研究应用包括：

1. 基因转录：PCR可以在特定的时间点检查的细胞类型，组织和生物体中基因转录的变化。在此过程中，从目标样品中分离出RNA，然后反转录为cDNA。然后可以从PCR中扩增的cDNA数量中定量特定基因的RNA原始水平。

2. 基因分型：PCR可以在特定的细胞或生物体的等位基因检测序列的变化。一个常见的例子是转基因生物的基因分型，例如敲除和敲入小鼠基因。在实验中，设计引物以扩增转基因部分（在转基因动物中）或突变（在突变动物中）。

3. 克隆和诱变：PCR克隆是一种广泛使用的技术，其中将通过PCR扩增的双链DNA片段插入载体（例如gDNA，cDNA，质粒DNA）。例如，能够创建已删除或插入遗传材料的细菌菌株。定点诱变还可用于通过克隆引入点突变。这通常采用称为重组PCR的技术，其中重叠引物经过专门设计以掺入碱基取代（如下图4）。该技术还可以用于创建新颖的基因融合体。

   

   图4：描绘重组PCR的实例的图。

   
   

4. 测序：PCR可用于富集模板DNA进行测序。建议用于制备测序模板的PCR类型称为高保真PCR，它能够保持DNA序列的准确性。在Sanger测序中，PCR扩增的片段随后被纯化并在测序反应中进行。在下一代测序（NGS）中，PCR用于文库制备阶段，在该阶段DNA样品通过PCR富集以增加起始量，并用测序适配器标记以允许多重化。桥式PCR也是第二代NGS测序过程的重要组成部分。

PCR作为一种独立技术和其他方法中的主力军，已经改变了一系列学科。这些包括：

• 遗传研究 ：PCR已在全球大多数实验室中使用。最常见的应用之一是基因转录分析，旨在评估特定基因转录本的存在或丰度。它是通过克隆操作生物（动物，植物和微生物）遗传序列的有力技术。这使基因或基因的一部分能够被插入，删除或突变，以通过遗传标记工程化改变表型，阐明基因功能并开发仅举几例的疫苗。在基因分型中，PCR可用于检测特定细胞或生物体等位基因中的序列变异。它的使用也不限于人类。农业植物基因分型协助植物育种者选择，精炼和改善育种资源。如上所述，PCR也是富集测序样品的**步。例如，人类基因组计划（HGP）中的大多数作图技术都依赖于PCR。

• 医学和生物医学研究 ：PCR被用于许多医疗应用，从与疾病相关的基因突变的诊断测试到传染原的鉴定。在医学领域使用PCR的另一个很好的例子是产前基因检测。产前基因检测通过PCR可以鉴定胎儿的染色体异常和遗传突变，从而为父母将来成为重要的信息，说明他们的婴儿是否患有某些遗传疾病。PCR还可以用作植入前的遗传诊断工具，以筛选用于体外受精（IVF）程序的胚胎。

• 法医科学 ：我们独特的遗传指纹意味着PCR可以在亲子鉴定和法医调查中发挥作用查明样品的来源。例如，可以将从犯罪现场中分离出的小型DNA样本与DNA数据库或犯罪嫌疑人的DNA进行比较。这些程序确实改变了警方调查的方式。真实性测试还利用PCR遗传标记来确定例如肉类来源。分子考古学也利用PCR从考古遗迹中扩增DNA。

• 环境微生物学和食品安全：通过PCR检测病原体，不仅在患者样品中，而且在食品或水等基质中，对于诊断和预防传染病都至关重要。

  从生物医学研究到法医应用，PCR是检测各个领域核酸的基准技术。Kary Mullis的想法写在路边一张收据的背面，现在的结果证明PCR是一种革命性的想法。

文章来源：药时空