佐剂是增强免疫反应的程度、广度和持久性的疫苗重要组成成分。在1920年代推出之后，明矾在接下来的70年里仍然是**获准供人类使用的佐剂。自1990年代以来，被许可的疫苗中佐剂又包含了其他五种，但对这些佐剂起作用的分子机制仍只是部分了解。然而，我们对通过模式识别受体(PRR)激活先天免疫系统的理解正在提高对佐剂免疫机制的理解，最近的概念性进展突出了组织损伤、不同形式的细胞死亡以及代谢的概念。营养传感器也可以调节先天免疫系统以激活适应性免疫。此外，使用系统生物学探索驱动疫苗免疫反应的分子网络的最新进展也揭示了相关机制，并为疫苗的发现和开发过程提供了新的思路。在这里，我们回顾了佐剂的“现在”和“未来”，讨论了一些新兴概念，并强调了我们对先天免疫和系统疫苗学不断扩展的知识如何积极用于COVID-19疫苗新型佐剂的科学开发和未来流行病疫苗的佐剂开发。

概括

佐剂是一种添加到疫苗中以刺激和增强免疫反应强度和持久性的物质。

疫苗一般包括两种成分：抗原和佐剂。抗原通常由源自病原体的蛋白质或化合物组成，机体需要对其产生适应性免疫反应。佐剂是一种添加到疫苗中以刺激和增强免疫反应强度和持久性的物质。佐剂这个词（源自拉丁语“adjuvare”，意思是“帮助”）是由法国兽医加斯顿·拉蒙创造的，他于1920年在巴斯德研究所工作时发现。令人惊讶的是，使用铝盐开发的疫苗比可溶性类毒素产生更好的抗体反应。从那时起，铝佐剂被使用到数十亿剂疫苗中，并且每年向数百万人接种。

新疫苗佐剂的开发被描述为医学史上最慢的过程之一。自1920年代最初获得许可以来的七年多时间里，不溶性铝盐（明矾）仍然是疫苗产品中包含的**佐剂，例如针对乙型肝炎、白喉、破伤风和百日咳或人类乳头状瘤病毒的疫苗。然而，在1990年代后期，水包油乳剂佐剂MF59首次出现在欧洲一种名为Fluad的许可产品中，该产品是一种针对季节性流感的三价灭活疫苗，可用于65岁以上的成年人。在此后的20年中，其他四种佐剂已包含在其他疫苗产品中：AS01（用于带状疱疹疫苗Shingrix和疟疾疫苗Mosquirix）、AS04（用于乙型肝炎疫苗Fendrix和人乳头瘤疫苗Cervarix）、AS03（用于大流行性流感疫苗Pandemrix和Arepanrix）和胞嘧啶磷酸鸟苷(CpG)1018（用于乙型肝炎疫苗Heplisav-B）。尽管在此期间许多其他佐剂已在临床前模型中显示出高效力，但大多数尚未获得许可，主要是出于安全性或耐受性方面的考虑。此外，尽管它们被广泛使用，但可用佐剂（包括明矾、MF59和AdjuvantSystems AS0佐剂）在人体中实际发挥作用的分子机制尚不清楚。

尽管如此，过去二十年见证了我们对先天免疫系统如何感染微生物的革命，这为进一步了解佐剂设计和开发提供了巨大的机会。在90年代后期，人们发现受体如Toll样受体（TLR）的活化，对树突状细胞（DC）和高度保守的病原体相关分子模式（PAMP）在微生物中导致DC激活，刺激抗原特异性T和B细胞反应。这些发现为CharlieJaneway在1989年提出的概念提供了强有力的实验证据：先天免疫系统通过识别受体（PRR；例如TLR）感知微生物，这些受体识别PAMP导致先天免疫细胞的激活以及随后的适应性免疫反应。在TLR发现后的十年中，其他PRR（如视黄酸诱导基因I(RIG-I)和其他RNA传感器）、DNA 传感器（如干扰素基因刺激物(STING)蛋白）、C型凝集素、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLR)和细胞质受体——例如NLRP3，它们激活炎症小体，也被发现并显示影响适应性免疫。靶向这些受体的分子也被视为潜在的疫苗佐剂。

尽管取得了这些重大进展，但我们对许可疫苗中包含的可用佐剂如何实际发挥作用的机制理解仍然不完善。然而，过去十年发生的两项重大进展开始对佐剂的作用机制产生更深入的了解。首先，免疫学家关于如何刺激免疫系统的观点已经超越了Janeway最初提出的PAMP模式识别模式。因此，有证据表明DC和先天免疫系统的其他细胞不仅可以通过PRR被病原体感知激活，还可以通过导致释放损伤相关分子模式(DAMP)的组织损伤激活，经由细胞死亡，以及其它应激信号，例如氨基酸饥饿（通过古应力和养分感觉途径）。许多这些刺激已被证明可诱导适应性免疫，从而为PollyMatzinger在1994年提出的“危险模型”概念提供支持。其次，使用系统生物学方法来探测对疫苗的先天性和适应性免疫反应，并定义驱动人类对疫苗接种的先天性和适应性免疫反应的分子网络，开始产生关于如何启动和控制免疫反应的基本新机制见解。这种“系统疫苗学”方法现在越来越多地用于评估人类对疫苗接种的免疫反应，以确定可以预测疫苗功效分子特征并获得机制见解。在这篇综述中，我们讨论了这些进步如何研究佐剂科学。首先，我们讨论了许可产品中佐剂的已知经验和差距。其次，我们讨论了关于佐剂作用的免疫学机制的几个新兴概念。在最后一节中，我们提供了一个概念框架，其中我们强调了基于系统的方法如何辅助设计和开发佐剂。

已经被许可的疫苗佐剂

活疫苗中的内源性佐剂

尽管可供临床使用的佐剂屈指可数，但是，许多已在数十亿人中安全使用的疫苗都含有内源性佐剂。先天免疫的概念进步和关键先天受体PRR的研究，使人们认识到许多广泛使用的活疫苗通过激活特定的PRR来诱导免疫反应。这些疫苗由活的减毒病原体组成，这些病原体通过表达各种PAMP激活先天免疫。例如，黄热病减毒活疫苗(YF-17D）是有史以来最有效的疫苗之一，已被开发并在全球6亿人中使用，被证明可以通过多个TLR（TLR2、TLR3和TLR7）发出信号来激活先天免疫系统。TLR9以及通过RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)（如下图1）。重要的是，TLR信号也是YF-17D的免疫原性必需的，尽管不应低估通过减毒病毒复制持续表达抗原的额外影响。类似地，卡介苗（BCG）预防结核病，其中超过四十亿剂量已被使用，激活TLR2，TLR4，TLR9和CD209抗原（也被称为DC-SIGN）。此外，某些灭活疫苗也会触发TLR，例如通过TLR7和骨髓分化初级反应88(MyD88)信号通路激活先天免疫系统的季节性流感疫苗。这些发现进一步表明TLR激动剂作为佐剂设计中的关键靶点的持续合理开发，特别是在不含内源性佐剂的亚单位疫苗的背景下。许多研究已经证明合成TLR配体作为疫苗佐剂在小鼠和非人灵长类动物(NHP)中的功效，可促进对重组蛋白抗原、病毒样颗粒或DNA编码抗原的疫苗接种的增强和更持久的抗体反应。

图1.佐剂的分子靶点。a图、Toll样受体(TLR)TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6在细胞表面表达，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9在核内体中表达。TLR1和TLR6与TLR2异二聚化，并通过髓样分化初级反应88(MyD88)通路发出信号以激活NF-κB和MAP激酶，导致促炎和抗炎细胞因子的分泌。TLR4和TLR5作为同源二聚体发挥作用，并通过MyD88通路发出信号。TLR7和TLR9也使用MyD88通路，但会迅速激活IRF7以诱导I型干扰素。TLR3使用包含TIR域的接头诱导IFNβ(TRIF)信号通过IRF3诱导I型干扰素。b图、细胞溶质模式识别受体(PRR)是存在于细胞质内的病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)的传感器。核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLR)是细菌PAMP的胞质传感器，但也识别多种细胞产物，包括ATP、尿酸和K+以激活NF-κB通路并诱导驱动T辅助细胞2(TH2）细胞分化。视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)是细胞内病毒传感器，通过IRF3和IRF7驱动I型干扰素反应。cGAS干扰素基因刺激剂(STING)通路识别双链DNA(dsDNA)以诱导NF-κB通路。图c、C型凝集素受体(CLR)是在多个骨髓细胞亚群上表达的细胞表面分子。Dectins1和2以及MINCLE通过CARD9-BCL-10-MALT1复合物募集SYK1并激活NF-κB。此外，已显示dectin 1分别在巨噬细胞和树突细胞(DC)以及体外实验模型中诱导NFAT和AP1通路。Dectins还专门用于诱导抗真菌免疫。树突状细胞特异性ICAM3抓取非整合素1(DC-SIGN)通过p65的乙酰化激活NF-κB；然而，尽管已显示诱导IL-10表达，但对由此产生的基因表达知之甚少。已知DEC205和DNGR1可诱导交叉呈递，但信号通路未知。ASC，含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白；CpG，胞嘧啶磷酸鸟苷；双链RNA，双链RNA；LPS，脂多糖；ssRNA，单链RNA；TDM，海藻糖-6,6-二霉菌酸酯；T_regcell，调节性T细胞。

活病毒疫苗通常诱导人强大和持久的抗体反应，与灭活疫苗佐剂能诱导这种强大和持久的抗体反应的可能性。在发现黄热病疫苗通过多个TLR配体与多个DC亚群结合的基础上，我们设计了含有TLR4和TLR7/TLR8配体作为佐剂的合成纳米颗粒，与可溶性蛋白抗原（如鸡卵清蛋白）结合使用或也可以使用流感血凝素。小鼠实验表明，这些纳米颗粒疫苗诱导了强大而持久的抗原特异性抗体反应：生发中心(GC)反应、T滤泡辅助 (TFH)细胞反应和长寿浆细胞(LLPC)。值得注意的是，这些由TLR配体组合引起的强烈反应在小鼠中持续了一生，并且需要激活多个DC子集和直接激活B细胞。在NHP中随后的研究表明，这样的纳米颗粒包封的TLR配体在刺激健壮和持久的抗体应答的有效佐剂，GC和TFH细胞应答，并且一直持续到研究终止在70周LLPCs的高频。似乎产生 LLPCs可能是产生抗体反应持久性的关键，驱动LLPCs分化的佐剂将在疫苗学中特别感兴趣。因此，开发促进LLPCs的佐剂是疫苗学的一大挑战。

最近的工作表明，以延迟动力学释放抗原的缓释递送系统（如渗透泵）可以增强抗体反应的幅度、质量和持久性。尽管这归因于由于抗原在淋巴结中保留时间较长而导致GC反应增强，但尚未彻底评估佐剂对先天细胞的持续激活的影响。在这种情况下，发现3M-052，一种从给药部位缓慢释放的新型TLR7/TLR8激动剂，导致单核细胞和DC的激活可持续3-4周，并且诱导持续抗体反应和LLPCs比用明矾观察到的要高得多（高达 100倍），持续到免疫后70周的研究终止点以后。

明矾

明矾是最常用的佐剂可诱导抗体应答和CD4+人类T辅助细胞应答（如下表1）。这些T辅助应答是T辅助2（T_ħ2）细胞偏置在小鼠内，但这种偏差在人类中不太清楚。长期以来，人们一直认为明矾主要通过“储存效应”机制介导其佐剂效应，该机制涉及抗原从免疫位点的缓慢释放。与此一致的是，与传统的明矾吸附抗原相比，用重复磷酸丝氨酸(pSer)残基组成的短肽对抗原进行化学修饰可增强与明矾的结合，从而延长免疫原生物利用度，并大大增强GC和抗体反应。此外，明矾实际上对免疫系统有多种影响。如上所述，虽然TLR似乎对黄热病疫苗YF-17D等活病毒疫苗的免疫原性至关重要，但是明矾加抗原免疫刺激的免疫反应在缺乏参与TLR信号传导的关键接头蛋白的小鼠中不受影响：MyD88或包含TIR结构域的接头诱导IFNβ(TRIF)。这表明明矾佐剂作用是通过独立于TLR信号的机制发生的。后来的研究表明，明矾激活了NLRP3炎症小体，尽管关于这在介导明矾佐剂作用中的相对重要性的数据是相互矛盾的。在NLRP3信号传导缺陷的小鼠中评估明矾增强的免疫反应的实验似乎给出了NLRP3炎症小体激活是否是适应性免疫反应所必需的相互矛盾的结果（见下表1）。

表1.已许可疫苗中使用佐剂的“已知”和“未知”。

明矾还可以通过引起组织损伤，诱导尿酸介导的炎症性DC激活来增强适应性免疫。明矾的注射迅速引起各种细胞，包括中性粒细胞，嗜中性粒细胞，其染色质组成的胞外陷阱。在释放DNA部分介导明矾的佐剂活性。例如，在小鼠中，用抗原加明矾进行免疫可诱导细胞死亡和随后宿主细胞DNA释放，从而刺激抗原特异性IgE反应和TH2细胞反应。TH2细胞反应与IgE同种型转换相关通过依赖于TANK结合激酶1(TBK1)和转录因子IRF3的机制，它们是由胞质DNA传感器STING介导的信号通路的关键组成部分（如上表1）。在其中一些研究中，将DNase制剂与明矾和抗原共同注射会降低对疫苗接种的免疫反应。然而，随后的一项研究报告称，商业DNase制剂被蛋白酶污染，这是导致 DNase制剂对明矾佐剂活性的一些抑制作用的原因。尽管如此，DNase在一定程度上降低了明矾诱导的反应，但DNase的作用似乎与其切割DNA的能力无关。因此，未来的工作应旨在阐明DNA传感在介导抗体和CD4+T辅助细胞反应的诱导中的相对重要性，这些反应由明矾加抗原免疫诱导。明矾也在已在某些国家被批准用于有限或应急使用灭活的病毒COVID-19疫苗中使用（如下表2）。因此，明矾的作用机制是复杂的，在小动物中可能有几个因素同时起作用，制剂的作用不容忽视。

表2.COVID-19疫苗中限制使用或处于临床试验中的疫苗佐剂

MF59

MF59是一种水包油乳剂佐剂，自1997年以来在欧洲已包含在获得许可的流感疫苗中，现在已被用于30多个国家的1亿多人。这种佐剂包含角鲨烯油滴，一种可生物降解的生物相容性油，是人体的正常成分，通过表面活性剂吐温80和司盘85在水性缓冲液中稳定，它们是常用的非离子表面活性剂。其作用机制已被探索并进行了审查。简而言之，在肌肉中用MF59会激活骨髓细胞（如巨噬细胞和DC），这些细胞通过产生趋化因子如CC-趋化因子配体2（CCL2）、CCL4、CCL5和CXC-趋化因子配体8（CXCL8，也称为IL-8)，进而将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和更多的单核细胞和DC募集到注射部位（如上表1）。这些细胞进一步放大响应并迁移至引流淋巴结以激活B和T细胞。小鼠研究表明，MF59比明矾诱导更广泛的细胞因子和趋化因子，并迅速将CD11b+炎症细胞募集到注射部位。这些基于小动物研究的观察结果在很大程度上得到了NHP中进行的类似研究的证实。将MF59佐剂流感疫苗肌肉注射到小鼠体内，导致ATP的瞬时细胞外释放，局部注射三磷酸腺苷双磷酸酶（一种ATP水解酶），抑制细胞募集和抗原特异性CD4+T细胞反应以及由MF59诱导的抗体反应，但不是由明矾或不完全弗氏佐剂。这些数据表明MF59佐剂疫苗诱导的ATP瞬时释放介导了适应性免疫反应。

关于参与感知MF59的先天免疫受体，证明MF59佐剂的抗体反应依赖于MyD88，但独立于NLRP3炎症小体激活的免疫MYD88敲除，用针对一个MF59佐剂疫苗的小鼠脑膜炎奈瑟氏球菌（rMenB）导致较低的抗体滴度与对照小鼠获得的那些进行比较。然而，令人惊讶的是，MF59并未激活表达TLR的HEK293细胞系中的TLR信号传导，这使得结论，MF59通过独立于TLR的MyD88依赖性机制诱导抗体反应。在一项独立研究中，将含有MF59佐剂的H5N1亚单位疫苗免疫接种到具有细胞凋亡相关斑点样蛋白基因缺陷的小鼠中，该蛋白含有CARD(ASC)，NLRP3炎性体中的一种衔接蛋白，导致H5特异性IgG抗体滴度降低相对于在野生型小鼠中观察到的结果。有趣的是，这个研究一致，Nlrp3-knockout和Casp1-knockout小鼠的反应是完整的，MF59佐剂疫苗通过ASC依赖性但不依赖炎症小体的途径诱导抗体反应。最后，我们最近的工作表明，用MF59加抗原对小鼠进行皮下免疫会刺激抗原特异性CD8+T细胞反应（在引流淋巴结中以非常低的幅度受到刺激，但可以在组织中以更高的频率检测到，例如肺和肝脏），通过依赖于受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)的机制，它是坏死性凋亡的关键介质。因此，用与MF59或其模拟物Addavax混合的抗原免疫小鼠，但不与明矾混合，诱导淋巴结巨噬细胞的快速RIPK3依赖性坏死性凋亡。RIPK3缺陷小鼠在肺和肝脏中产生抗原特异性CD8+T细胞反应的能力受损，以响应用抗原加Addavax的皮下免疫。然而，令人惊讶的是，这种反应在缺乏混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的小鼠中是正常的，这是一种坏死性凋亡的下游介质，这表明在RIPK3缺陷小鼠中观察到的CD8+T细胞反应受损是通过一种独立的机制发生的。与对CD8+观察到的影响相反T细胞，抗体反应在RIPK3缺陷小鼠或半胱天冬酶1缺陷小鼠中不受影响。然而，它们受到泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK的影响，这表明凋亡半胱天冬酶对诱导抗体反应的贡献。这些在小鼠中的观察提供了对基于角鲨烯的佐剂（如MF59）的佐剂作用的机制见解，但这种机制在人类中的作用程度仍有待确定。

AS0佐剂系统

佐剂系统AS0由葛兰素史克在过去三十年中开发，基于经典佐剂分子（包括明矾、乳剂和脂质体）的合理组合，与免疫刺激分子联合使用（如TLR 配体等）。

AS04

AS04由3-O-desacyl-4'-单磷酰脂质A(MPL)组成，这是一种从明尼苏达沙门氏菌中提取的脂多糖(LPS)形式，吸附在铝盐上。重要的是，对小鼠的研究表明，当吸附在明矾上时，MPL通过TLR4激活保持其完整的免疫刺激活性。AS04的佐剂作用是通过TLR4对先天细胞的信号传导以及明矾的固有免疫调节特性介导的（如上表1）。与仅添加明矾佐剂的相同抗原相比，将AS04添加到基于重组抗原的乙型肝炎病毒(HBV)和人乳头瘤病毒(HPV)疫苗中可诱导更高水平的抗体，证明TLR4激动剂MPL在人类中的附加价值。较高的免疫原性也转化为HPV-16/18疫苗的高且持久的功效。现在可用的数据表明，在初次免疫后9年多，疫苗方法的效力可以达到100%。需要进一步研究以更好地了解AS04佐剂HPV疫苗这种有益作用背后的确切机制。例如，通过尚未明确定义的机制，加入AS04可导致更广泛的针对人类不同HPV毒株的免疫反应。

AS03

AS03是一种角鲨烯水包油型乳剂佐剂，与MF59类似，但还含有α-生育酚（维生素E）作为额外的免疫增强成分。AS03与流行性流感疫苗联合获得许可（如上表1）。AS03是在临床试验中被评估作为疫苗佐剂用于众多不同的重组病毒刺突蛋白COVID-19疫苗（如上表2）。AS03增强了抗体反应和CD4+T细胞反应的幅度和广度，与非佐剂疫苗相比，增强了对流感的保护。小鼠和人研究表明，AS03会触发短暂的先天免疫反应，尽管可能还涉及其他作用机制。在小鼠中，AS0 刺激注射部位和引流淋巴结中细胞因子的瞬时产生。α-生育酚调节某些趋化因子和细胞因子的表达，如CCL2、CCL3、IL-6、粒细胞集落刺激因子（G-CSF，由CSF3编码）和CXCL1，增强单核细胞的抗原摄取并增加粒细胞向引流淋巴结。随后在小鼠中进行的一项研究表明，肌肉注射AS03引起了引流淋巴结中参与脂质代谢的基因的快速和瞬时下调。在体外，在骨髓细胞系中，这些变化与脂质成分的变化和内质网(ER)形态的改变以及未折叠蛋白反应(UPR)通路的激活有关。在体内，用内质网应激反应的化学抑制剂或内质网应激传感器激酶IRE1α的髓样细胞中的基因缺失进行治疗可减少IL-6的产生. 在人类中，在接种AS03佐剂的H5N1禽流感疫苗后24小时内，IL-6和IP10（也称为CXCL10）的血清水平以及DC中干扰素信号传导和抗原加工和呈递的转录特征增加，单核细胞和中性粒细胞。有趣的是，发现干扰素信号的这种早期上调可以预测56天90时的抗体滴度。鉴于AS03和MF59都是基于角鲨烯的佐剂，它们很可能参与先天免疫激活的共同途径。如上所述，这两种佐剂都会刺激先天细胞因子和趋化因子，但它们都依赖IRE1α和RIPK3依赖途径的程度仍有待确定。

AS01

AS01包含在获得许可的水痘带状疱疹疫苗(Shingrix)中，该疫苗被批准用于老年人（50岁及以上），具有高效效力(97.2%)。佐剂AS01是两种不同免疫刺激成分的独特组合——AS04(MPL)中使用的TLR4配体和分离纯化的皂苷级分(QS-21)——也用于获得许可的疟疾疫苗，该疫苗目前正在以有限的条件在非洲实施。QS-21是一种从Quillaja saponaria Molina树的树皮提取物中纯化的三萜糖苷。使用QS-21佐剂的临床前研究显示增强的抗体以及细胞介导的免疫反应。然而，尽管单独使用QS-21是有效的，但当用作人类疫苗中的单组分佐剂时，对其耐受性存在重大担忧。在AS01中，MPL和QS-21在胆固醇存在下一起配制在脂质体中，胆固醇用于将QS-21结合到脂质体中并抑制其反应原性。MPL通过TLR4激活先天免疫系统，主要是通过TRIF依赖性信号传导。此外，对小鼠的研究表明，QS-21激活引流淋巴结98中的囊下窦巨噬细胞(SSM)中的半胱天冬酶1（如上表1）。尽管QS-21对半胱天冬酶1的激活在体外是NLRP3依赖性的，但NLRP3似乎在体内佐剂中没有作用。当在脂质体中配制时，QS-21通过依赖胆固醇的内吞作用进入细胞并诱导溶酶体不稳定，然后是酪氨酸蛋白激酶SYK激活。总的来说，两个单独分子对不同先天通路的特异性激活的组合对于AS01的完全佐剂作用至关重要，因为TLR4、半胱天冬酶1或SSM的消耗单独损害了小鼠模型中的佐剂作用。因此，AS01的一个显着特征是产生协同作用以诱导新的途径，而这些途径不是单独由任一成分触发的。关键的紧急途径似乎与IFNγ相关，因为在体内阻断IFNγ会消除MPL和QS-21的协同作用。对AS01佐剂的典型免疫反应的特点是增加了对共同给药抗原具有特异性的多功能CD4+T 细胞（例如表达IL-2、IFNγ和TNF的T细胞），以及增强的功能性抗体。总之，在AS01中，两种成熟的佐剂分子结合在一种新型递送系统（脂质体）中，导致先天免疫的协同参与，从而诱导的适应性免疫反应大于独立成分的个体总和。尽管如此，尽管在临床前模型中已经学到了很多东西，但关于AS01如何在人类中发挥作用仍有很多需要学习的地方，特别是在老年受试者中，在这些已获许可的佐剂中，它似乎具有克服“免疫衰老”的非凡能力。

总之，佐剂系统AS0通过多种机制发挥其作用，具体取决于配方中使用的成分。使用已经处于临床前或临床试验各个阶段的佐剂组合，创建合理的组合以**限度地提高效力，同时确保可接受的耐受性和安全性也已到位，以实现成功的产品开发。尽管如此，获得许可的道路漫长、艰巨且具有挑战性，我们希望在吸取的经验教训的基础上，在未来将其缩短。我们相信，使用系统生物学方法的人类研究将继续产生关键经验教训，尤其是那些专注于挑战小动物研究中出现的作用机制假设的经验教训。

胞嘧啶磷酸鸟苷1018

TLR9有三类CpG寡核苷酸配体，它们可以通过不同的核苷酸序列基序和它们在浆细胞样DC中刺激IFNα的能力来区分（如上表1）。TLR9激动剂CpG 1018是一种22聚体未甲基化的CpG-B 类寡核苷酸，是一种有效的TH1细胞佐剂，可刺激强B细胞和NK细胞活化。CpG 1018目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗的潜在疫苗佐剂进行评估（如上表2）。此外，该分子是Heplisav-B的一个组成部分，Heplisav-B是一种改良的HBV疫苗，已获准用于成人（年龄>18岁）。虽然还有其他HBV疫苗已经获得许可并被广泛使用，但它们通常以三剂方案给药，而Heplisav-B的主要优势是它提供了一种简化的两剂方案。在小鼠的临床前研究中，与无佐剂或明矾佐剂的制剂相比，CpG核苷酸对各种抗原（包括HBV的表面抗原、HBsAg）诱导了显着更高的抗体反应。然而，TLR9在小鼠中的表达模式与人类和猕猴不同。在小鼠中，许多细胞类型，包括单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，表达TLR9，而在人类和猕猴中，TLR9的表达严格限于浆细胞样DC和B细胞，这突出了了解新佐剂作用的分子机制的重要性。最后，上述不同类别的CpG分子的不同免疫刺激能力似乎取决于它们是否以单体或多聚体形式出现。因此，单体CpG-B寡核苷酸定位于溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)阳性内体并促进浆细胞样DC成熟，但很少或不产生IFNα；然而，当复合到微粒中时，CpG-B定位于转铁蛋白受体1(TFR1)阳性内体并通过TLR9依赖性机制导致IFNα的产生。此外，单体CpG-B可以很容易地被B细胞吸收并刺激它们的活化。相比之下，由于其回文结构而自发形成纳米颗粒状复合物的CpG-A也定位于TFR1+内体在浆细胞样DC中并刺激IFNα产生，但不能被B细胞吸收，B细胞不会内化较大的DNA复合物，如CpG-A。刺激适应性免疫以响应CpG加抗原免疫的先天机制和细胞类型似乎也取决于CpG的形式。因此，用可溶性CpG-B加抗原免疫小鼠，通过依赖于DC中TLR9介导的MyD88激活的机制诱导TH1 CD4+T细胞和抗体反应。相反，使用聚合形式的CpG-B加抗原进行免疫似乎并不严重依赖于DC中的MyD88信号传导，认为其他先天细胞在感知聚合形式的CpG和引发适应性免疫中的作用。

佐剂生物学中的新兴概念

佐剂在CD8+T细胞反应中的作用

尽管佐剂可以增强人体对疫苗接种的抗体反应这一点已经得到公认，但迄今为止，还没有佐剂显示出能诱导由YF-17D等活病毒疫苗刺激的抗原特异性CD8+T细胞反应的强度。有人认为抗原的初始剂量和持久性是CD8+T细胞反应的主要决定因素。然而，对人类活病毒疫苗诱导的免疫反应的分析表明，抗原负荷和佐剂信号在诱导适应性免疫反应中都起着关键作用。

在小鼠中，几种免疫原与一系列佐剂结合可诱导有效的CD8+T细胞反应。相比之下，在人类中，只有黄热病和天花等活病毒疫苗才能诱导非常高的抗原特异性效应CD8+T细胞反应和记忆CD8+T细胞反应。由于这些是复制疫苗，因此这些研究强调了初始病毒载量（抗原）决定了人类CD8+T细胞反应的大小。YF-17D小鼠实验表明DCs的激活，通过多个TLRs和由此产生的MyD88信号，驱动CD8的诱导+T细胞。此外，YF-17D通过RNA传感器RIG-I和MDA5发出信号。因此，需要解决的一个重要问题是是否有佐剂可以模拟活疫苗在人类诱导CD8+T细胞反应方面的效力。积累的经验表明，亚单位疫苗，即使与有效的佐剂一起递送，也不会在人类中诱导CD8+T细胞反应，至少在血液中测量如此。然而，TLR配体或TLR的配位体的组合用抗原可诱导抗原特异性CD8递送+小鼠中的T细胞应答。抗原特异性CD8+T细胞还可以在小鼠中通过靶向C型凝集素受体的CLR，如DEC205的DC，以促进抗原交叉呈递至CD8+T细胞。这些策略已成功的应用到小鼠，但它仍然是具有挑战性把这些结果以NHP中或人，尽管观察到的CD8+T细胞应答可通过增强TLR配体与可溶性抗原的物理连接。此外，目前可用的佐剂诱导低得多的幅度CD8+相对于病毒疫苗如YF-17D或天花的T细胞应答，尽管CD4+T细胞应答是由亚单位疫苗更容易地诱导。基于DNA的疫苗和重组病毒载体已经以初免-加强方案的形式进行了广泛的测试。但仍然没有诱导CD8+的量级。用活病毒载体观察到的T细胞反应。因此，发现能诱导细胞介导的亚单位疫苗免疫反应的佐剂仍然是未来的挑战。在这种情况下，应该指出的是，使用mRNA疫苗进行的COVID-19疫苗试验的最新结果表明，人类的CD8+T细胞反应水平很高。因此，在BioNTech/Pfizer的mRNA疫苗的I/II期试验中，产生IFNγ的CD4+T细胞和CD8+SARS-CoV-2受体结合域(RBD)刺突蛋白的特异性T细胞约为每百万外周血单核细胞(PBMC)700和400个，高反应者每百万个PBMC有多达4000个。与此一致，通过细胞内细胞因子染色，RBD特异性CD8+T细胞的频率非常高，几个疫苗接种者的频率高达总T细胞库的4%RBD特异性CD8+T细胞。这种高强度CD8+的机制基础mRNA疫苗诱导的T细胞反应尚不清楚，但可能是由于核酸感应受体或其他机制激活先天免疫系统，以及抗原持续一段时间，可能是几天或一周左右。

最后，现在提高组织常驻记忆性T细胞（T利息RM细胞），这一般被认为是组织内长期居住，并提供针对病原体的一线防御。T RM细胞定位为在屏障位点再次感染时快速响应。病原体进入粘膜部位后，识别病原体的TRM细胞会迅速被激活，并刺激局部微环境中的邻近细胞激活和募集免疫细胞并建立抗病毒状态。我们最近在NHP中的研究表明，接种疫苗诱导的T RM粘膜组织中的细胞在重新激活后，会在常驻骨髓细胞和CD4+T细胞中诱导抗病毒基因表达程序。值得注意的是，TRM细胞先天性串扰显着降低了抵御粘膜猿-人类免疫缺陷病毒(SHIV)挑战所需的中和抗体滴度。因此，佐剂研究的一个主要挑战是开发可以诱导大量T RM细胞的佐剂。

总的来说，这些观察结果表明，在人类中诱导有效的CD8+T细胞反应需要**的佐剂信号传导，以及抗原的持续存在，至少持续几天。理想情况下，抗原存在的动力学及其分布可以设计为类似于施用活病毒疫苗后观察到的动力学。例如，对黄热病疫苗YF-17D免疫反应的分析表明，激活多种先天免疫受体（TLR、RIG-I或MDA5）是诱导CD8+T 细胞反应所必需的。此外，持续存在一周左右的抗原，正如预期在急性病毒感染期间可能发生的那样，也可以促进CD8+T细胞反应。因此，佐剂未能在人类中诱导CD8+T细胞对灭活疫苗的反应表明需要更好地控制抗原负荷、持久性和分布。众所周知，复制病毒疫苗，如YF-17D和天花，会在人类中诱导急性病毒感染，这可能会促进全身多个部位的CD8+T细胞的启动，从而导致更大数量的CD8+T细胞反应。因此，未来的研究应着眼于更好地定义抗原和佐剂的持久性和分布参数，并优化这些参数以确定有效产生CD8+的潜力。

佐剂设计和开发的前沿

免疫学的最新进展突出了佐剂开发的新细胞和分子靶标。

• 诱导CD8+T细胞和组织驻留记忆T细胞（T RM 细胞）的佐剂：开发新型佐剂，在人类中诱导大量抗原特异性CD8+T细胞和T RM细胞，类似于活病毒载体诱导的诱导比如黄热病疫苗。

• 针对非Toll样受体(TLR)模式识别受体(PRR)的佐剂：开发针对TLR以外的PRR的新型佐剂，包括核酸感应受体，如视黄酸诱导基因I(RIG-I)，干扰素基因刺激物 (STING)蛋白、C型凝集素受体(CLR)和核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLR)。

• 代谢佐剂：养分传感器，例如mTOR和GCN2具有在调节树突状细胞（DC）的功能和适应性免疫的关键作用。靶向DC中此类代谢调节剂的小分子可能代表新的佐剂。

• 细胞死亡佐剂：现在已知DC对死细胞的吸收可导致细胞尸体来源的抗原交叉呈递给CD8+T细胞。特别是，最近的工作强调了受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)介导的坏死性凋亡可以与NF-κB依赖性炎症协同促进CD8+T细胞反应。此外，最近的工作表明，MF59在促进CD8+T细胞反应方面的辅助作用主要由坏死性凋亡的关键介质RIPK3介导，但通过与坏死性凋亡无关的途径。

• 后生佐剂：近期的工作表明，先天细胞包括单核细胞和巨噬细胞发生表观遗传修饰和采集存储器样在与病原体相关分子模式（PAMP）的刺激特性。因此，靶向此类细胞的小分子可能代表表观遗传佐剂，可刺激先天反应的特定方面（例如抗病毒状态，包括干扰素刺激基因(ISG)）的高度激活。这种表观遗传重编程的抗病毒状态将在一段时间内（可能是几周左右）提供对多种病毒的抵抗力。

不仅仅是DC

的DC长期以来被认为是疫苗佐剂的初级细胞靶。事实上，有明确的证据表明DC对TLR配体的佐剂活性至关重要。因此，在DC缺陷的小鼠中，TLR配体的佐剂活性严重受。即使对于非基于TLR的佐剂，如alum或MF59，DCs或DCs亚群的条件性缺失也会导致适应性免疫反应的严重损害。这些研究明确地将DC作为感知佐剂和调节适应性免疫的关键细胞类型之一。然而，免疫系统是一个复杂的相互作用细胞类型网络，尽管DC在先天感知和协调免疫反应中发挥核心作用，但新出现的证据强调了其他细胞类型在此过程中的关键作用。例如，如前所述，明矾和MF59的给药诱导肌肉细胞的转录变化，比在DC中更是如此。此外，由MF59诱导的肌肉细胞释放ATP对其佐剂活性至关重要。此外，响应于佐剂诱导的趋化因子信号，在肌肉给药部位更容易检测到单核细胞和粒细胞，并对体外刺激做出更有效的反应。此外，B细胞的直接刺激似乎是产生持久的浆细胞反应的一个同样重要的因素。因此，在B细胞中选择性缺乏TLR信号的嵌合小鼠在用TLR配体加抗原进行免疫时产生抗体的能力严重受损。与此一致，B细胞内在的MyD88信号被证明对于刺激抗原特异性B细胞和抗体对病毒样颗粒的反应是必不可少的。淋巴结定居巨噬细胞也具有在MF59和QS-21。最后，很少有研究检查佐剂对上皮细胞的影响，尽管这些细胞经常代表外部刺激的**次接触。因此，未来的工作应该旨在更全面地评估参与佐剂先天感知的不同细胞类型，以及它们协调适应性免疫反应的机制。

也不仅仅是TLR

尽管过去十年中佐剂发现的主要焦点是靶向TLR途径，但现在很明显可以靶向其他PRR以实现佐剂效果。新一代佐剂可利用的受体包括NLR、RIG-I样受体(RLR)、CLR和 STING配体。值得注意的是，通过包括TLR在内的大多数PRR发出信号会诱导一些局部组织和细胞损伤，由此释放的DAMP似乎是几种佐剂的佐剂活性的关键组成部分。例如，NLRs，细菌PAMPs的细胞质传感器，识别多种细胞产物，包括ATP、尿酸和K+流出，表明该激活是潜在地由细胞损伤介导的（如上图1）。

STING和RIG-I通路的配体被认为是刺激小鼠强健CD8+T细胞反应的潜在佐剂。例如，最近的一项研究描述了2',3'-cGAMP在小鼠体内诱导强效CD8+T细胞，但特别令人感兴趣的是2',3'-cGAMP观察到的显着肿瘤消退。的RIG-I和RLRS提供了另一种可能的机制刺激被探索到可能诱导CD8+T细胞应答。最近表明，环状RNA在体内激活RIG-I，可用作佐剂来诱导细胞介导的以及抗体反应。进一步评估环状RNA编码蛋白是否可以诱导更强和更有效的CD8+T细胞反应将是有趣的，因为表达的抗原是细胞内的，以便由主要组织相容性复合体(MHC)I类进行有效呈递。

代谢、细胞死亡和表观遗传学

如上所述，在过去十年中越来越清楚的是，先天免疫系统不仅可以通过PRR感知微生物，而且还能够感知各种组织损伤和压力信号。例如，组织损伤可由外伤、自身免疫或感染引起，并导致细胞死亡和细胞外释放大量DAMP，如ATP或尿酸，或DNA或RNA片段或高迁移率族框1(HMGB1)，它可以激活DCs以刺激适应性免疫。这提出了是否可以利用这些先天激活途径设计新型佐剂的问题。事实上，有新的证据表明已经在临床中使用的佐剂确实可以通过这些途径刺激免疫反应（如下图2a）。例如，如上所述，有证据表明，在小鼠中，明矾会导致细胞死亡并随后释放宿主细胞DNA，后者在刺激免疫反应中充当DAMP。此外，如上所述，将MF59佐剂疫苗注射到小鼠体内会刺激细胞外释放ATP，通过局部注射腺苷三磷酸双磷酸酶对其进行抑制会减弱免疫反应。

图2.其他模式的识别受体。最近的研究已经深入了解了可以针对佐剂活性的新途径。a、由外伤、感染和自身免疫引起的组织损伤会导致多种损伤相关分子模式(DAMP)的释放，包括核酸、尿酸、ATP和蛋白质，例如高迁移率族框1(HMGB1)，它们会激活先天性免疫系统。b、由不同刺激诱导的细胞死亡也会释放DAMP。特别令人感兴趣的是由不同刺激引起的细胞死亡机制。专门的细胞死亡途径，如坏死性凋亡和细胞焦亡，可以激活先天免疫细胞。诱导特定细胞死亡途径的小分子可能是有效的佐剂。c、细胞代谢是作为免疫反应的中央调节网络出现的第三个概念。免疫细胞，例如树突状细胞(DC)，在不同组织中具有不同的代谢状态。这些见解源于对黄热病疫苗诱导的人类免疫反应的系统分析，其中氨基酸传感器GCN2作为持久CD8+T细胞反应的早期关联物而出现。黄热病疫苗在DC中激活GCN2可增强抗原通过自噬向T细胞呈递。此外，中枢代谢调节剂mTOR 显示对先天免疫反应具有多种影响，尤其是DC。d、卡介苗(BCG)等疫苗和β-葡聚糖等病原体相关分子模式(PAMP)会诱导表观遗传变化，使先天免疫系统长时间保持在警戒状态。靶向适当细胞类型的小分子提供了有吸引力的新型佐剂成分。H3K4me3，组蛋白H3在Lys4处三甲基化；H3K27ac，组蛋白H3在Lys27乙酰化；MHC，主要组织相容性复合体；NK细胞，自然杀伤细胞；P，磷酸化；TF，转录因子；TH1细胞，T辅助1细胞；uORF，上游开放阅读框。

细胞死亡佐剂

细胞死亡也已成为免疫反应的关键调节因子。早期工作表明，通常不会预期进入DC细胞质的外源性抗原可以转移到细胞质中，在那里它们可以被加工或呈递给MHC I类以刺激CD8+T细胞免疫力。许多实验室的后续工作帮助建立了这种由DC呈递抗原的途径，并证明DC也可以从凋亡细胞中获取抗原，将这些抗原交叉呈递给CD8+T细胞。然而，过去十年的研究揭示了细胞死亡的多种方式，并且很多努力都集中在了解坏死的机制上，例如necroptosis和pyroptosis。坏死的由RIPK1，其自磷酸化介导的，然后募RIPK3，其介导性坏死的激酶活性。RIPK1依赖性细胞死亡途径和NF-κB依赖性炎症的协同作用协同促进CD8+T细胞的交叉引发增强。有趣的是，用MF59加抗原免疫小鼠会导致淋巴结巨噬细胞坏死和抗原特异性CD8+T细胞（在引流淋巴结中以非常低的数量存在，但在肺和肝脏中检测到的频率要高得多）。有趣的是，RIPK3介导的CD8+T细胞刺激通过独立于MLKL的机制发生，这表明RIPK3通过独立于坏死性凋亡的机制介导CD8+T细胞的激活（如上图2b）。总之，这些发现表明可以靶向淋巴结中的巨噬细胞以瞬时诱导RIPK3介导的途径（包括细胞死亡）的小分子可能代表刺激CD8+T细胞反应的佐剂（如上图2b）。

代谢佐剂

近年来获得动力的另一个概念是，骨髓细胞（如巨噬细胞和DC）的代谢状态可以编程它们的先天反应和刺激T细胞的能力。因此，在不同成熟阶段的DC，或在不同的组织，具有不同的代谢状态。例如，中枢代谢调节因子mTOR复合物在介导TLR诱导的浆细胞样DC分泌I型干扰素方面起主要作用，影响髓样DC中IL-12的分泌，并代谢重编程肺DC，以将过敏性炎症从嗜酸性TH2转向嗜中性TH17细胞极性，通过导致增强的IL-23和脂肪酸氧化的机制。

此外，氨基酸传感器eIF2α激酶GCN2可以调节骨髓细胞的先天功能及其诱导T细胞反应的能力。例如，YF-17D刺激DC中的GCN2活化，导致增强的自噬和抗原呈递给CD8+和CD4+T细胞（如上图2c）。相比之下，GCN2导致炎症小体激活的抑制，其机制涉及自噬体中NLRP3的激活剂活性氧(ROS)的隔离。此外，GCN2通过增加转录因子CREB2（也称为 ATF4）翻译的机制改变骨髓细胞功能并促进针对抗肿瘤反应的免疫抑制，这是巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞的成熟和极化所必需的。这些结果表明DC中代谢调节剂（如mTOR或GCN2）的药理学调节可能代表了模拟免疫反应的辅助策略。

表观遗传佐剂

最近出现的另一个概念是先天免疫记忆或“训练的免疫力”。有人提出，髓细胞，如单核细胞和巨噬细胞或NK细胞，在用PAMP刺激后获得类似记忆的特征。这种“先天存储器”取决于在初级刺激，能使细胞是以下的二次刺激或者高反应性或低反应性诱导持续后生编程。疫苗（如BCG）和PAMP（如β-葡聚糖）在单核细胞和巨噬细胞中诱导组蛋白H3在Lys4（H3K4me3）处三甲基化和H3在Lys27（H3K27ac）处乙酰化（如上图2d）。这些变化在消除刺激后持续数周，导致表观遗传状态增强。在与相同或不同的PAMP二次刺激，这种增强的后生状态诱导增强基因表达的。一个有吸引力的可能性是将小分子作为药理学调节剂靶向适当的细胞类型，以重新编程先天免疫记忆的表观遗传景观。特别是，人们可以设想靶向单核细胞或其他骨髓细胞的小分子进行表观遗传重编程，刺激先天反应的特定方面的高度激活，例如在一段时间内提供对病毒的增强抵抗力的抗病毒状态，也许几个星期左右。这种表观遗传佐剂可用于印记增强的抗病毒状态，从而赋予人类对多种病毒的抵抗力。在大流行期间，例如 COVID-19 大流行期间，使用此类表观遗传佐剂可能特别有利，可在可能几周的有限时间内在易感人群中增强抗病毒耐药性。

佐剂的持续作用

免疫学的主要范式之一是快速反应的先天免疫系统感知微生物刺激，然后对随后的适应性免疫反应进行编程。然而，新出现的数据也表明，通过直接靶向适应性免疫系统的细胞（如B细胞），佐剂信号在免疫反应的后期阶段具有潜在的持续作用。免疫接种在抗原摄取的疫苗的结果被DC，并且通过佐剂其激活包含在疫苗，TLR的通过或其它的PRR（如下图3）。活化的DC将抗原呈递给幼稚抗原特异性CD4+T辅助细胞，它们存在于淋巴器官的富含T细胞的区域。诱导的T辅助细胞反应的大小和类型在很大程度上取决于佐剂的性质和触发的PRR。激活的T辅助细胞迁移到B细胞滤泡和T细胞区域之间的界面，在那里它们刺激抗原激活的B细胞的克隆扩增。这些活化的抗原特异性B细胞迁移到淋巴结中的髓索并分化为短寿命的浆细胞。其他活化的B细胞迁移到B细胞滤泡中形成GC。此外，一些辅助性T细胞上调BCL-6，其诱导CXCR5和CCR7的表达，使迁移到T细胞的B细胞边界，在那里它们与相互作用的抗原特异性B细胞。这些T_FH细胞提供IL-21 和CD40L信号，这对于B细胞增殖和GC细胞或浆细胞的分化至关重要。根据B细胞呈递给T FH的肽MHC II类抗原的量，抗原特异性B细胞相互竞争T_FH细胞帮助，在T细胞-B细胞边界处提供细胞因子和共刺激信号细胞。反过来，来自B细胞的信号，包括CD40L、IL-6、IL-12 和 IL-23，刺激T_FH细胞的发育和它们迁移到新生的GC，在那里它们在协调记忆的发展中发挥核心作用B细胞和LLPCs。因此，T_FH细胞代表了佐剂设计的有吸引力的目标；特别是，为了更深入地了解DC子集和此类子集上的PPR，需要触发这些子集以诱导增强的T_FH细胞反应。在这种情况下，我们最近在NHP中的工作表明，在纳米粒子或明矾中配制的合成TLR7/TLR8配体称为3M-052可诱导非常高的T_FH细胞反应和GC反应，以及显着持续的骨髓LLPC，它们以非常高的水平持续70周，这是研究的终止点。基于这些结果，目前正在评估用明矾配制的 3M-052 作为人类 HIV Env 抗原的疫苗佐剂 (ClinicalTrials.gov NCT04177355)。

图3.超越先天/适应性免疫，佐剂辅助继续发挥作用。先天免疫系统感知佐剂并对随后的适应性免疫反应进行编程是佐剂如何发挥作用的当前模型。活化的树突状细胞(DC)将抗原呈递给T细胞区域中的幼稚抗原特异性CD4+T辅助细胞(T_H细胞)。一些活化的T_H细胞上调CXCR5，CXCR5介导它们迁移到B细胞滤泡和T细胞区域之间的界面，在那里它们表达IL-21和CD40L，刺激抗原激活的B细胞的克隆扩增。虽然一些抗原特异性B细胞迁移到髓索并分化为短寿命的浆细胞，但其他活化的B细胞迁移到B细胞滤泡中形成生发中心(GC)。GC中的B细胞随后可以分化为再循环的记忆B细胞，或迁移到骨髓的长寿浆细胞(LLPC)。已知许多佐剂主要通过靶向DC来诱导其活化和抗原呈递而起作用，但新出现的研究表明，Toll样受体(TLR)配体等佐剂也可以靶向B细胞。MHC，主要组织相容性复合体；TCR，T细胞受体。

尽管在免疫反应的早期“先天”阶段通过特定的PRR靶向特定的DC亚群是一种公认的佐剂作用机制，但新出现的证据表明，即使在GC期间，佐剂也可以为B细胞反应提供“继续教育”发展阶段。在GC中，激活的抗原特异性B细胞迅速增殖，并在编码其免疫球蛋白受体的基因中发生体细胞超突变。结果，产生了B细胞的新特异性，包括那些结合免疫抗原的能力增强的细胞。GC B细胞竞争在滤泡树突细胞(FDC)上表达为免疫复合物的抗原，优先选择那些对抗原具有最高亲和力的细胞，并分化为迁移到骨髓的记忆B细胞或LLPC。这个过程导致抗体反应的“亲和力成熟”。活化的B细胞表达TLR，并且可以响应TLR刺激。特定TLR的组合可以驱动持久性GC响应，并且如上面提到的，B细胞固有的MyD88信号是至关重要的，以刺激抗原特异性B细胞和抗体应答。此外，固定剂量复合剂表达的TLR和固定剂量复合剂的TLR介导的激活是用于GC分化和亲和力成熟关键。因此，这种机制可能是诱导高亲和力抗体和LLPC分化的关键，这对于诱导持续的抗体反应至关重要，这是疫苗学的一大挑战。这些观察结果表明，佐剂可能不仅在先天反应的早期阶段靶向 DC，而且还可能在影响GC反应和记忆B细胞分化方面发挥持续作用。

佐剂配方的力量

合成分子与天然产物

尽管目前最成功的佐剂，包括在许可产品中的，主要由来自天然来源的成分组成，但我们认为这不一定反映了21世纪早期“成功”的**途径。必须承认，最成功的佐剂中使用的成分在1990年代早期及之前普遍可用。因此，它们是当时包含在产品开发计划中的**材料，因为它们随时可用且有效，即使它们的作用机制通常知之甚少。然而，既然先天免疫对佐剂作用的关键作用有了更多的认识，合成化学促进了新分子的开发，这些分子可以更好地设计为纯激动剂。虽然最初在TLR激动剂的发现，对于其他先天激活系统的新颖激动剂的搜索很快跟随。这些新发现的佐剂的固有特性使它们比它们可能会取代的原始天然分子更适合产品开发。理想情况下，新发现的佐剂是小分子，可以设计为纯激动剂，具有机械洞察力，可以调节激动水平以控制激活信号。

已建立的配方与创建新配方方法

因为这样的小分子激动剂从颗粒呈现大大受益，化学操作可使其适合配制成优选的递送系统，其中在溶解性和相容性剖面灵活性。最近对动物模型的研究强调了基于纳米颗粒的疫苗的价值。在这里，纳米颗粒的物理特性，例如它们的大小和表面抗原密度，可以影响它们的免疫原性。此外，在纳米颗粒表面以多聚体形式展示的糖基化抗原可以与先天免疫防御蛋白结合，例如甘露糖结合凝集素(MBL)，这有助于它们快速穿梭到GC中的FDC，从而增强抗体反应。在小鼠和猕猴中的实验表明，制剂还可以调节抗原的释放动力学，这会影响抗体反应的强度。

已经建立了几种用于许可产品中包含的佐剂的配方方法。这些包括用作吸附剂的不溶性铝盐、易于注射的低油含量、水包油乳液和脂质体输送系统。尽管这些系统在组成上非常不同，但它们有一些重要的相似之处。它们都制成纳米颗粒，但不溶性明矾佐剂通常是纳米颗粒的稳定聚集体，其聚集成平均尺寸为几微米的颗粒。重要的是，明矾、乳剂和脂质体也可以作为抗原和免疫增强剂的有效“输送系统”，包括TLR激动剂（最显着的是TLR4、TLR7和TLR9）。3M-052也使用几种不同的方法配制而成。

最后，开发这些传递系统的一个主要挑战是向人类的翻译。通过聚合物颗粒控制释放抗原在概念上一直很有吸引力，并获得了很多支持，因为已经有完善的可生物降解聚合物可用于人类。然而，在这种方法的早期出现了许多挑战，尽管付出了很多努力，但还是无法克服；之前已经总结了这些挑战。简而言之，大多数重组抗原在纳米颗粒封装过程中被降解或在封装后仅部分释放，并且捕获通常效率低下，由于“浪费”抗原而导致高成本。尽管在小动物体内的表现通常很好，但由于一些固有的缺陷，产品开发没有明确的途径。这些包括以下事实：颗粒通常需要在非常专业的设施中进行昂贵的无菌制造，并且释放和质量控制测定非常具有挑战性，因为需要从待测定和定量的颗粒中回收捕获的抗原。

因此，最近成功将概念转化为人类的一个例子是从最初的SMIP发现开始的正在进行的临床项目。在鉴定出新型TLR7激动剂后，虽然有临床前数据显示使用多种递送系统的可能性，但做出的决定是临床评估吸附在明矾上的分子。理由是明矾是成熟、安全和有效的，并且已经为监管机构所熟知。因此，新分子最初以“熟悉”的形式呈现，因此所有问题都可以仅集中在新化合物的临床特征上，因为它可以与既定的安全有效疫苗一起轻松评估。该制造方法也适用于明矾，并用于许多产品中，并可以实现**产品呈现形式的潜力，如液体单瓶或预装注射器。此外，由于AS04的成功，这种方法已经被确立为提供TLR激动剂的实用方法。因此，对于包含新型佐剂的疫苗，遵循了先前成功的产品开发途径。重要的是，SMIP 方法固有的灵活性允许对分子进行化学修饰，以确保吸附到明矾佐剂上，从而实现快速临床评估，而无需建立新的制造工艺。令人鼓舞的是，到目前为止，吸附在明矾上的TLR7激动剂看起来具有潜在的安全性，并且对人类具有良好的耐受性。

只包括必要的东西

确保每个组成部分都是必要的并增加明确的价值，同时不引入大量不合理的责任，能够合理构建改进的佐剂。AS01是目前许可产品中包含的最成功的佐剂，基于产品实现的功效水平，对水痘带状疱疹的功效>97%。在开发AS01之前，关键成分MPL和QS-21都已被确定为佐剂，并且已经进行了相当长的一段时间的独立探索。然而，对AS01佐剂开发至关重要的一个见解是，这两种分子一起导致了先天激活的协同作用。这两种分子共同诱导了一种先天激活模式，无论剂量水平如何，单独一种都不能诱导这种激活模式。重要的是，为了实现这种协同作用，开发了一种脂质体递送系统，允许将两种免疫增强剂共同递送至相同的免疫细胞群。使用已建立的明矾或乳液方法无法实现这种共同递送，因此脂质体的开发是完全合理的。重要的是，脂质体制剂在降低QS-21诱导显着局部和全身反应原性的潜力方面也有效。因此，AS01是一个很好的例子，说明添加额外组件需要多么有力的理由，但可以根据结果来证明新方法的合理性。

佐剂开发的新框架

系统疫苗学

开发含有新型佐剂的疫苗的既定方法被描述为医学中最慢的过程之一。几十年来，佐剂开发依赖于对小鼠候选分子的系统测试、将有希望的候选分子推进到 NHP 模型中以及最终在人类中进行测试（如下图4a）。然而，在动物模型中显示出强大免疫原性和功效的所有佐剂中，只有少数佐剂被证明对人类安全有效。缺乏从小鼠到人类的翻译的一个主要原因包括它们在大约6200万年前的进化差异，以及由此产生的重要免疫学差异（例如DC亚群中TLR7表达的差异），尽管它们的免疫系统（两者都是小鼠和人类有T和B淋巴细胞）。这些主要差异强调了在佐剂测试中利用人体模型的必要性。系统疫苗学的最新进展改变了我们以前所未有的精确度探测人类疫苗接种免疫反应的能力。

图4.佐剂开发的新框架。a、目前开发含有新型佐剂的疫苗的模型代表了从在小鼠身上系统测试新型候选疫苗到在非人类灵长类动物(NHP)中进行测试的有希望的候选疫苗的进步，以及最终在人类的多个阶段进行测试的线性进展。b、我们提出的新模型依赖于对小鼠、类器官培养物、NHP和人类的迭代测试过程。我们建议尽早使用小规模实验性人体试验和使用系统生物学方法来生成多参数免疫学读数，从而产生可以在临床前模型中重新测试的新假设和佐剂概念。

几十年来，疫苗制造商一直依靠单一的方法来评估对疫苗接种的免疫反应，通常是血清抗体滴度。这种方法的一个主要限制是它没有捕捉到对疫苗接种的免疫反应的复杂性，因此可能无法识别保护性免疫的相关性和关键机制。系统疫苗学使用转录组学、代谢组学、高维细胞计数和表观基因组学等高通量技术来全面分析疫苗接种的免疫反应，并使用通过此类分析产生的数据来描绘疫苗免疫的相关性和机制。使用基于系统的方法来研究疫苗反应的**项研究确定了在接种疫苗后1-7天内诱导的转录特征，该特征与随后的抗原特异性CD8+T细胞反应和中和抗体反应的大小相关，测量25天后。这项研究表明，黄热病疫苗引发了多个TLR，以及RIG-I和MDA5，并确定了预测疫苗免疫原性的先天特征。使用机器学习方法的进一步分析证明了这些特征能够预测随后的抗原特异性CD8+一项针对接受黄热病疫苗的受试者的独立研究中的T细胞反应和中和抗体反应。这项研究提供了一个概念证明，即系统生物学方法可用于预测疫苗免疫。在一项独立研究中，确定了由黄热病疫苗诱导的类似特征，这些特征与随后的适应性免疫反应相关。根据这些研究，一些研究小组已经用这种方法来研究对其他几种疾病，包括流感疫苗接种免疫应答的疟疾，脑膜炎和肺炎球菌感染和水痘带状疱疹病毒。重要的是，系统疫苗学方法已被用于识别跨多个流感季节和不同人群（老年人、糖尿病患者）的常见疫苗诱导特征。此类研究已经确定了与抗体反应的持久性相关的特征。

系统疫苗学研究已经产生了许多关于疫苗反应的新机制见解。例如，TLR5的表达显示在接种疫苗后的几天内被诱导，并且与几周后的抗体反应密切相关。随后的小鼠实验表明，缺乏TLR5的小鼠对季节性流感疫苗接种的抗体反应受损。这可能是由于来自肠道微生物群的鞭毛蛋白通过TLR5发出信号并提供辅助信号以增强抗体反应。因此，用广谱抗生素或无菌小鼠治疗的小鼠接种疫苗导致对流感疫苗接种的抗体反应受损。在这些研究的基础上，我们在人类中进行了一项研究，通过在季节性流感疫苗接种前后对健康人施用广谱抗生素来评估微生物群对季节性流感疫苗免疫反应的影响。结果显示，在预先存在的抗体滴度较低的受试者中，微生物组丢失导致H1N1特异性中和以及结合IgG1和IgA抗体反应的显着受损。此外，炎症反应增强（包括炎症小体激活的特征）和次级胆汁酸减少1000倍，这与炎症特征高度相关。多组学综合分析揭示了细菌种类与代谢表型之间的显着关联，突出了微生物组在人类免疫中的关键作用。这些研究揭示了系统疫苗学方法的力量：首先，确定人类疫苗反应的分子预测因子；然后，在小鼠模型中对它们进行实验验证；最后，在一项新的人类研究中测试这些机械见解。这突出了人类免疫学研究和小鼠机制研究的无缝连续性。系统疫苗学研究产生的其他机制见解包括证明氨基酸感应分子GCN2在调节DC功能以刺激T细胞对黄热病疫苗的反应中的作用。

推进佐剂开发

佐剂开发的新框架可能更加强调在小型临床试验（0/I 期）中测试许多潜在的佐剂概念，如下：

系统疫苗学如何推动新佐剂的发展

• 发现已建立的佐剂的作用机制以发现新的佐剂。目前对许可疫苗中使用的佐剂的分子和细胞作用机制缺乏详细了解，包括基于角鲨烯的佐剂，如MF59和AS03，以及基于皂苷的佐剂，如AS01b。系统疫苗学方法来探测由此类佐剂在人体中诱导的分子网络，可以阐明潜在的作用机制，然后可以在动物模型中进行实验验证。这种详细的机制理解可以帮助设计新颖的佐剂。

• 人早期0/I阶段测试以加速佐剂开发过程. 几十年来，佐剂测试一直在线性、单向路径上取得进展，首先是在小鼠中进行临床前测试，然后是在非人类灵长类动物中测试最有希望的候选药物，然后缓慢进展到人类临床测试。然而，由于小鼠和人类免疫原性的差异，将有希望的候选佐剂转化为人类。此外，对翻译失败的了解通常发生在发育过程的后期，通常是在临床前研究之后数年。因此，在发育过程的早期、小型0/I期试验中在人类中测试候选佐剂，并使用基于系统的方法来定义免疫原性特征将有助于加速佐剂的开发。这也将有助于基准佐剂和与其他成功的疫苗配方联合。

• 确定反应原性的机制和相关性。佐剂开发的一个主要考虑因素是安全性。有时，佐剂会引起不良反应原性，这通常发生在接种疫苗后的几天内，并且可以是局部的（例如红斑、肿胀或疼痛）或全身性的（例如发烧、肌痛、头痛和流感样症状）。除了这种反应原性外，在极少数情况下，还可能发生不良事件，例如接种佐剂疫苗后的过敏反应。回顾性、嵌套、病例对照研究可用于分析与对照相比来自此类不良事件的样本，以确定宿主对不良事件反应的潜在机制。

因此，可以在小型I期（0期）人体试验和系统疫苗学方法中快速测试新佐剂，用于获得机械见解。例如，Sékaly及其同事研究了在人类中合成的双链RNA的先天免疫应答（聚肌苷：胞苷酸（聚IC），与聚稳定升赖氨酸（聚ICLC），对于激动剂TLR3和MDA5。在皮下注射poly(ICLC)后，血液样本的转录分析显示所有受试者中参与多种先天免疫途径、干扰素和炎性体信号传导的基因上调，类似于黄热病疫苗观察到的特征。比较转录分析表明，在接种了高效黄热病疫苗的志愿者中，类似地诱导了几种先天免疫途径。因此，化学定义的PRR激动剂如聚（ICLC）可以是一种可靠且真实的微生物模拟物，用于诱导人类先天免疫反应。类似的研究可以在接种了新佐剂的人类中进行，这些佐剂可以针对成功的疫苗进行“基准测试”。此外，系统疫苗学研究可以深入了解佐剂在人体中的作用机制。即使对于目前用于许可疫苗的佐剂，包括基于角鲨烯的佐剂（如AS03和MF59）和基于皂苷的佐剂（如AS01b，它们似乎不会激活典型的TLR依赖性或其他PRR依赖的先天激活途径。关于基于皂苷的佐剂，最近一项COVID-19疫苗临床试验的结果与另一种称为Matrix-M1的基于皂苷的佐剂证明了高强度的中和抗体滴度，但缺乏关于此类基于皂苷的佐剂介导其作用的分子和细胞机制的详细知识231。此外，系统疫苗学方法不仅可用于定义佐剂的作用机制，还可用于定义制剂工作的潜在机制、疫苗接种后不久发生的不良反应的潜在机制以及疫苗递送**制剂的合理设计。从此类0/I期研究中获得的结果将有助于制定关于佐剂的机制假设，然后可以在动物模型或体外人类类器官培养物中进行测试(如上图4b)。

在这里，我们提出了一种改进的新佐剂合理设计和迭代测试模型——一种基于系统疫苗学的跨学科方法，以加速临床佐剂的发现和开发（如上图4）。基于我们在管理新佐剂到疫苗产品商业批准方面的经验，我们想强调早期使用人体研究的价值。从这些研究中产生的“组学”数据可以促进关于候选佐剂刺激强大而持久的抗原特异性T和B细胞反应的机制的新假设的形成。然后可以在动物模型中重新测试这些假设，然后可以使用随之而来的机制见解来设计新的佐剂概念。这种在佐剂开发管道的早期阶段利用人体模型与系统疫苗学领域相结合的方法具有振兴佐剂科学所需的变革潜力。

文章来源：药时空、Nature

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