干货分享 | 过程分析技术（PAT）解锁细胞培养耗氧模型
在生物技术和生物制药领域，细胞可以生产从小分子药物到高附加值的大分子药物。从字面上看，反应器相当于细胞培养生长的工厂。与我们现实中的工厂一样，工厂通常不能无人看管。有人需要确保机器得到良好维护和正常运行，有足够的监督并且通讯线路保持畅通。这种监督的程度取决于细胞培养的规模。研究技术人员可以每天目视检查T175瓶中的培养物，以便确定细胞密度和pH值。然而，尤其是在规模更大、工业化程度更高的细胞反应器中，需要监测的内容所涉及的参数要多得多，对于反应器中的细胞培养还必须记录、编辑和分析数据，有必要时可以对反应器参数进行及时的更改。
图片来源：梅特勒-托利多
生物制药过程的复杂性意味着在不同的产品和工艺知识或数据的收集中，将随着产品通过不同商业化阶段的进展而继续，即临床前研究和产品开发、工艺和产品表征、过程验证和常规制造。过程监控已成为证明制造过程处于受控状态和识别未来工艺改进的关键工具。现今，有一系列过程分析工具来监控您的生物反应器内部发生的事情。其中许多可以与分析和控制系统连接在一起，使反应器内部的细胞能够充分发挥其潜力。
反应器培养中需要监测什么？
制药公司应该计划和执行一个工艺和产品质量监控系统，以确保生产制造处在受控制状态。一个有效的监控系统可以保证过程和控制的持续能力，以满足产品质量和识别反应器工艺的优化和持续改进。温度、pH值和溶氧（溶氧对于快速生长的细菌或者细胞非常重要）可以通过直接插入生物反应器的探头进行监测。营养物质和副产物，如葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵，通常通过对培养基进行采样和分析来监测。更多基于细胞的测量，如密度、活力和形态学，常用光学方式（显微镜、细胞计数仪）进行评估。许多因素会影响仪器和自动化在线监测探头在生物培养过程中的实时监控，其中最重要的是细胞培养的各个参数。
数据管理
除了对培养基或细胞进行测量外，在线分析还可以处理和存档数据、绘制图表和比较生长情况以及编译监管文件。这是一种趋势，客户要求设备与其工艺过程管理系统兼容。智能传感器管理系统可以在其中连接多种不同的仪器，并管理所有不同的参数数据。您可以连接在线生化分析仪、pH计、溶氧等等。该信息用于自动向生物反应器控制系统提供反馈，告诉它们什么时候添加更多葡萄糖。METTLER TOLEDO iSense软件是ISM传感器的支持和维护工具。凭借其直观的界面和全面的功能，您可以采用一种完全可控的方法在从**次安装到最后淘汰处置的整个生命周期管理您的传感器，实现其使用价值**化。
统计技术已被证明能够对生物技术应用中大量的复杂数据集进行严格分析。这与允许在线分析的分析工具的进步相结合，可以构成实时过程监控的基础。实施此类系统会提高产品质量的一致性以及生物技术产品的生产效率，并使我们更接近全面实施QbD并实现其收益。
DO和pH传感器是在线测量培养参数的普遍方法。METTLER TOLEDO在线溶氧传感器是一种对多种工业过程中的溶氧进行实时连续监测的分析仪器。工业溶氧探头采用耐用简单的设计，可确保在所有过程条件下进行精确测量。为了确保满足所有需求，METTLER TOLEDO提供了可用于生物制药中各个应用的在线溶氧传感器。
过程分析技术(PAT)是生物制药制造过程中越来越重要的一个方面。监管机构也发布了PAT的监管框架，并一直在敦促制药行业及供应商积极的开发创新工具和技术，用于生物制药生产单元操作的质量控制和保证。质量源于设计(QbD)框架鼓励使用PAT工具“将质量构建到整个工艺中”，而不是“将质量停留在测试产品中”。
细胞培养中的溶氧控制
工艺的稳定性源于关键工艺参数 (CPP)、关键性能指标(KPI)和关键物料属性(CMA)的稳定，所有这些都会反过来影响关键质量属性（CQA）。CPP可以在整个工艺中发生变化，因此需要不同的控制策略来减少过程可变性。近几十年来，过程分析技术(PAT)和质量源于设计(QbD)方法的进步显着缩短了工艺开发时间。当然这也离不开先进的在线参数监测，而反应器培养中溶氧对培养至关重要，梅特勒-托利多在线溶氧传感器可以满足我们对反应器工艺中溶氧的精确测量。下面我们就通过一个例子来说明溶氧对反应器培养的重要性。
在许多生物生产过程中，控制溶解氧并将其保持在一定水平以上是至关重要的。正确调整溶氧(DO)控制器的比例值(Proportional Integral Value)对于生物反应器中的**细胞培养条件至关重要。经过优化的DO与PI值，使通气气流变得平滑，并且细胞的反应应力也会相应的减少。传统上，控制溶氧的通气策略是通过使用氮气从测试培养基中清除氧气来执行的，从而模拟氧气需求。然而，这种方法有几个缺点。首先，氮气不能模拟高密度发酵的高要求。其次，氮气与其他气体也存在竞争，尤其是在使用质子流量计控制系统中，人工清除培养基中的溶氧通常不会在实际的细胞培养工艺中。第三，氮气不能用于测试四种气体的控制策略，其中的氮气只会用于平衡DO作为通气策略的一部分。
在这种情况下，我们使用一种现阶段比较流行的方法，使用亚硫酸钠(Na2SO3)、焦亚硫酸钠 (Na2S2O5)和二氧化硫(SO2)等化学除氧剂模拟DO需求的方法。使用除氧剂来消耗DO，测量氧气转移速率（OTR）的方法已有报道。在合适催化剂存在的情况下，除氧剂可快速消除培养基中的DO。例如，以铜为催化剂，亚硫酸钠与氧气反应生成硫酸钠（参见如下方程式1）。
控制亚硫酸钠的浓度及其进入生物反应器的进液速率可以模拟细胞培养的氧气需求。重复此实验，每次运行使用不同的PI值来确定最有效的溶氧通气策略。使用生物反应器提供的执行PI调节模拟的方法。操作员可以使用带有内置调节曲线功能的集成泵来控制随时间添加到反应器中的亚硫酸钠溶液的量。下面我们以**仓鼠卵巢(CHO)细胞为例，描述了这种模拟培养物需氧量以进行PI调整的方法，使这种方法很容易应用于其他细胞系的通气策略确定。
使用一次性5L反应器及相应的控制系统；使用梅特勒-托利多的溶氧（DO）电极及相应的辅助系统；将所有使用溶液连接到反应器上。模拟培养基使用磷酸盐缓冲液(PBS)代替培养基。
通过首先将氮气以0.5L/min(standard liter perminute，SLPM)通入反应器中的注射用水至少半小时以清除溶解氧DO，将亚硫酸钠制备为0.5M溶液。接下来，将315g无水亚硫酸钠快速小心地添加到注射用水中。将所得溶液用搅拌混合直至亚硫酸钠完全溶解。为了抑制氧气再次溶解，在剩余的实验中以0.1SLPM向溶液中连续通入氮气。
将500mL去注射用水和25g 五水合硫酸铜(II)分别配制到500mL玻璃瓶中来制备硫酸铜溶液。将溶液在搅拌混合，直到所有硫酸铜溶解，由于硫酸铜对光敏感，瓶子用锡箔纸包裹。
实验装置：下图1显示了本实验反应器的示意图。将反应器的磁力搅拌驱动、温度探头、DO传感器（梅特勒）和加热毯连接组装好。将pH传感器插入反应器端口，并将容器放置在秤上。在零点和量程校准后，容器充满3L PBS。反应器参数使用下表1中列出的参数进行设置。
硫酸铜溶液的泵管放置在反应器114DV蠕动泵头中。然后将6mL硫酸铜溶液泵入生物反应器，使其浓度为每1L PBS含2mL硫酸铜。Na2SO3泵管放置在系统的另一个114DV蠕动泵中。打开蠕动泵，设置为0mL/min。废液通过硅胶管连接到生物反应器的收集管道，该管道放置在314DV蠕动泵中。此泵设置为收获模式，以防止在泵入亚硫酸钠时溢出。
时间曲线设置：通过反应器时间曲线控制向反应容器中添加亚硫酸钠。基于在过去的CHO培养过程中观察到的氧需求随培养时间增加而增加，创建了一个模拟的氧需求曲线。模拟培养时间加快了10倍，以便将典型的7到10天的分批培养过程压缩为一天的模拟实验。模拟完成后，数据从反应器数据记录的趋势图中导出以进行分析。
结果与讨论
我们围绕系统默认PI值P=5(0.7-5)和I=0.3(0.06-0.3)测试了不同设置。图2A-D显示了时间剖面模拟的结果。时间曲线中使用的函数近似于实际CHO培养物的需氧量。这种方法使我们能够很好地模拟此类需求，以有效地测试不同的PI值。基本的PI调整方法不需要额外的软件或编程经验。在我们的CHO细胞分批培养示例中，发现P=2和I=0.09的值最有效。这些值减少了设定点附近的DO波动，并**限度地减少了气体流量的波动。
培养过程在重组蛋白（如疫苗、抗体和临床应用药物）的生产中非常重要。哺乳动物细胞的生理学高度敏感，因此需要复杂的培养工艺。需要可靠的传感器设置来控制主要工艺参数，例如 pH值、溶解氧、二氧化碳等。如果这些设定点没有得到严格控制，那么产品质量和数量可能会改变。例如，溶氧控制测量和溶氧稳定对抗体糖型造成影响。不同型号反应器即便设置相同DO值，糖型还是会有变化，这是因为各个反应器由于通气设置方式相差较大，从而使达到同样DO水平的方式和溶氧波动方式产生不同。报道称，溶氧波动10%-90%变化时，抗体糖型末端半乳糖残基和唾液酸残基**变化量分别达20%和30%；而低溶氧水平（10%）下，三天线结构糖型（高甘露糖）和末端唾液酸残基的糖型数量会增加。
随着生物治疗行业采用PAT和QbD范式，对快速和强大的在线监测工具的需求将继续增长。在线传感器可以很好的满足这一需求，可以在整个反应器工艺中收集所需要的信息。在过去的10年中，上游微生物和哺乳动物细胞培养中的在线监测应用呈指数增长，预计在不久的将来，下游单元操作也会发生这种情况。学术界和制药工业界对连续下游过程的兴趣迅速增长，这将放大这种影响，因为当批量模式产品质量测试不再是一种选择时会出现独特的实时PAT控制挑战。
文章来源：https://mp.weixin.qq.com/s/4lqFLHc6wgKkSx_TeU53zw