流式细胞术知识分享 — 数据分析篇

在前几期的流式细胞术知识分享中，我们为大家介绍了仪器、试剂以及应用方面的知识。今天，我们将介绍最后一部分——数据分析。

目前，传统的双参数直方图(点状图)“门控”分析方法仍然被频繁使用。但随着流式细胞术实验的参数和复杂性的增加，新的聚类数据分析方法得到使用，比如PCA、SPADE以及tSNE等，这些新的数据分析方法使研究者能够从流式细胞术高维数据中提取有用的信息。

FCS文件格式创建于1984年，用于标准化流式细胞术列表模式数据文件。所有流式细胞术数据文件都有“.fcs”文件扩展名，以被任何的流式细胞术分析程序读取。目前，FCS文件标准是FCS 3.1。

常规的流式细胞术分析，即选定目标细胞群所在区域（门控），并根据实验需要，选择参数对选定的细胞群进行分析。例如，辅助T细胞群先根据CD3+、CD4+的表达被选定。之后，再根据活化标记物（比如CD25）的表达选定活化细胞群所在区域，进行活化分析。

常规流式细胞术分析中的“门控”

除了与流式细胞仪配套的软件之外，还有多种商业化计算机程序能够用于流式细胞术数据的分析。目前，最常用的流式分析软件有FlowJo、WinList、FCS Express、Kaluza和WinMDI。

FlowJo	Kaluza	FCS Express

细胞周期分析软件程序使用倍性建模来确定由 DNA 直方图表示的细胞周期阶段。ModFit LT是一个专门用于这类分析的程序。此外，FlowJo有一个细胞周期分析模块。

使用常规流式细胞术分析方法对高维数据进行分析是繁琐的，会消耗大量时间，因为高维数据往往含有14个以上的参数。另外，使用常规的“门控”方法难以确定多个标记之间的关系，可能会导致目标细胞群的丢失。目前，已有多个新的分析工具可用于高维数据的分析以及可视化，比如SPADE (Spanning-tree progression analysis of density-normalized events)，tSNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)，PCA (Principal component analysis)，以及FLOCK (FLOw clustering without K)。算法上，tSNE与PCA相似，但是tSNE能够比PCA识别出更多的共分离特性。tSNE可作为FlowJo和FCS Express的插件使用。

此外，Cytobank是一个高维数据的云端分析系统，分析参数可达30个以上。在这里，用户通过上传数据并选择相应的分析项目进行数据分析。Cytobank的聚类、降维和可视化工具充分利用云计算的可伸缩性，可快速进行大量分析。

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