2022超全“PCR异常曲线”分析! 你还不知道？！

随着实验的进行，扩增产物不断累积，相应的荧光信号也不断在增加，每进行一个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（比如40个循环），就可以得到下面的扩增曲线图（横坐标代表扩增的循环数cycle，纵坐标代表荧光的强度）。

这其中还需要弄清楚一些基本概念，如：

做标准曲线有啥用？标准曲线可以用来确定未知的样品的初始量。如果是需要绝对定量，是必须要有标准曲线的。

怎么做呢？每个模板的CT值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系的，起始的拷贝数越大，CT值就越小。标准品按照一定的倍数稀释5-6个浓度左右，根据RT-PCR的反应条件进行反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得来。

那么，问题来了，这个标准曲线的标准品怎么确定呢？

（1）如果是做绝对定量，标准品的要求比较高，这个的制备过程也相对复杂一些，但结果也更加精确。

要求：

必须是准确定量的、标准化的、稳定的质粒DNA（也可以是基因组DNA，纯化后的PCR产物等），

5-6个稀释梯度；

PCR反应仪器要同一种，并且同时操作；

反应的条件一致：反应体系、参数等等；

反正能一致的都一致就对了。

（2）如果只是想看看扩增效率（E）（E=10-1/斜率），检验PCR的反应体系是否符合要求，我们有时候也采用待测试样品作为标准品，逐步稀释后进行反应，最终看标准曲线的斜率和R2是否符合要求，我比较懒，常会用这种方法，不过有些发文章的要求会比较高，那还是要乖乖去做的。

简单点说，就是考察染料标记法结果的特异性的。再简单点，就是分分钟确定你的引物是否有效。

复杂的原理我就不解释了，关键是怎么看和怎么判断。如果反应产物单一，曲线会出现一个尖峰；如果有二聚体或者非特异性的扩增，就会出现至少两个峰或者更糟糕。采用SYBR Green染料时是必须要做溶熔解曲线的，毕竟这是一个非特异性的染料。

在实验中，大家还是会碰到很多问题的，下面列举几个比较常见的问题：

（1）扩增曲线经过40个循环后没有平台期？或者扩增曲线根本无法呈现指数上升？

这种情况下很有可能是你的起始模板浓度太低了，即便经过40个循环也是达不到平台期的，可以通过增加循环数来验证是否是该问题。

（2）熔解曲线的问题：比如多个峰，或者尖峰的前面有个小小的小峰，或者没有峰？

这个跟引物以及反应的体系温度有关系，如果说没有峰值或者杂乱无章，很有可能是引物的问题，建议重新设计引物。有时候有小的峰，可以通过优化反应条件，比如退火温度的优化来消除这个影响。

常见异常曲线分析：

图十：样本跟预混液未混匀现象

图十一：反应体系中有气泡

其他异常曲线，实战分析：

原因分析：H07存在扩增抑制

解决方案：将样本稀释后进行扩增（抑制物的影响可通过稀释样本消除）

原因分析：自动基线问题

解决方案：

原因分析：

（1）PCR参数设置错误：在设计循环参数时没有设置荧光信号采集；

（2）模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；

（3）引物或者探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

（4）电脑设置了自动休眠。

解决方案：

• 分液不准确，检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管；
• 反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，导致曲线呈斜直线状。

• 分液均匀，上机前检查八连管液面是否在同一水平线上；
• 八连管盖盖严，上机前检查是否有缝隙。

• 排除是否存在污染；
• 排除污染原因后复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增，如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。

原因分析：

原因分析：

（1）仪器不稳定导致的扩增曲线异常（也可能突然停电或者电压不稳）；

（2）如果尖峰向下，可能是卤素灯老化所致发射光源不稳定（指卤钨灯光源的激发器）

（3）如果是单一的孔位出现尖峰，除了考虑仪器或者孔位问题外，还要考虑反应体系是否有气泡所致。

解决方案：

按照原因分析进行一一核查，对症处理。